REVISTA BIO CIENCIAS

Inulinases, Agave, inulin, fructans, fructose, Kluyveromyces marxianus

RESUMEN

México es el centro de origen del género Agave spp. con un total de 159 especies endémicas, representando el 75 % de todas las especies conocidas. El principal uso de estas plantas es la producción de bebidas alcohólicas, particularmente tequila, el cual se obtiene a partir de las piñas de Agave tequilana Weber var. Azul, produciendo durante su obtención una gran cantidad de residuos y de hojas que no se utilizan, los cuales pueden ser considerados como desechos. Los principales constituyentes de estos subproductos de Agave son polisacáridos, especialmente los de tipo inulina. La presente revisión se enfoca a la utilización de estos desechos para la obtención de β-fructanasas (generalmente referidas como inulinasas), así como los avances en la producción de jarabes fructosados mediante el uso de estas enzimas. La inulina y los jarabes altos en fructosa han despertado mucho interés por sus beneficios a la salud debido a su bajo índice glicémico y a su función como prebiótico en la flora intestinal. Las inulinasas son producidas principalmente por los hongos del género Aspergillus y las levaduras del género Kluyveromyces. Estas últimas son preferidas en la industria debido a su alta tasa de crecimiento, por ser capaces de soportar temperaturas altas (52 °C) y por tener el estatus GRAS (Reconocido Generalmente como Seguro, por sus siglas en inglés) para poder ser utilizadas en la industria alimenticia. La presente revisión hace especial énfasis en los avances obtenidos en la producción de inulinasas mediante la levadura K. marxianus.

Mexico is the center of origin of the genus Agave spp. with 159 endemic species, 75 % of all known species. The main use of these plants is in the production of alcoholic beverages, mainly tequila, which is obtained from the “pines” of A. tequilana Weber var. Azul. During tequila production, a huge amount of waste is produced, including leaves that are not used. Main compounds found in these subproducts are polysaccharides, specifically inulin. Current review focuses on the use of these agricultural wastes to obtain inulinase production, and in the production of high fructose syrup using these enzymes in these wastes. Currently, high fructose syrups, especially oligosaccharides, have prompted much interest for their benefits to health due to its low glycemic index and their function as prebiotic in the intestinal flora. The main microorganisms involved with inulinases production belong to the genera Aspergillus and Kluyveromyces. The latter is preferred in the industry due to its high growth rate, high temperature tolerance (52 °C) and by having the GRAS (Generally Recognized As Safe) status. This review emphasizes on the advances achieved in the production of inulinases by yeast K. marxianus.

Introducción

Introduction

Las inulinasas (EC. 3.2.1.7) son producidas por microorganismos diversos, los más estudiados son las levaduras del genero Kluyveromyces, ya que se pueden encontrar en ambientes diversos, son termotolerantes, tienen tasa de crecimiento alta y no son peligrosas para el humano (Castillo y Chamy, 2010). Estas enzimas son las responsables de la hidrolisis de los enlaces β-2-1 de los fructanos del tipo inulina, el cual se puede encontrar como polisacárido de reserva y se puede utilizar en la producción de jarabes ricos en fructosa, oligofructanos, fructosa parcialmente pura y otros compuestos con utilidades industriales. La fructosa obtenida por hidrólisis enzimática presenta un rendimiento de 95 % y se obtiene en un solo paso enzimático, con lo que se reduce el costo de su producción y se evita la presencia de subproductos no deseados (Lafuente-Castañeda et al., 2012). La fructosa está tomando importancia debido a beneficios a la salud como edulcorante para diabéticos y por incrementar la absorción de hierro y calcio en el organismo (Madrigal y Sangronis, 2007). Una característica de las plantas de Agave spp., es que contienen una gran cantidad de fructanos, cerca del 65 % de los carbohidratos totales (Mancilla-Margalli y López, 2006), y de éstos la mayoría son inulina (Huitron et al., 2008). La mayor parte de la fructosa es utilizada en la fermentación para ser transformada en alcohol, este proceso produce desechos que no se utilizan y que si no son tratados correctamente se volverán contaminantes (Barragán-Huerta et al., 2008). Una solución a este problema es utilizar las pencas de desecho que se dejan en los campos, para la producción de microorganismos productores de enzimas de interés industrial, tales como las inulinasas.

The inulinases (EC. 3.2.1.7) are produced by diverse microorganisms, whereas the most studied are the yeasts of the Kluyveromyces genus, since they can be found in various ambiances, are thermotolerant, have a high growth rate and are not dangerous for human beings (Castillo and Chamy, 2010). These enzymes are responsible for the hydrolisis of the inulin-type fructans bonds β-2-1, which can be found as reserved polysaccharide and can be used in the production of syrups rich in fructose, oligofructans, partially pure fructose and others with industrial usefulness. The fructose obtained by enzymatic hydrolysis presents a 95 % performance and can be obtained in only one enzymatic step, which reduces the cost of its production and the presence of non-wanted subproducts is avoided (Lafuente-Castañeda et al., 2012). Fructose is taking importance due to its benefits to health as sweetener for the diabetic, and for raising the absorbance of iron and calcium in the body (Madrigal and Sangronis, 2007). A characteristic of the Agave spp. is its large content of fructans, near 65 % of the total of carbohydrates (Mancilla-Margalli and Lopez, 2006), and from those most are inulin (Huitron et al., 2008). Most of fructose is used in the fermentation in order to be transformed in alcohol; this process produces waste that is not used and that, if not treated correctly, will become pollutants (Barragán-Huerta et al., 2008). A solution to this problem is the use of the wasted leaf-stalks that are left in the fields for the production of microorganisms that produce industrial interest enzymes, such as inulinases.

Las plantas de Agave spp., también conocidos como magueyes, han sido aprovechados por el hombre durante miles de años. Su cultivo y aprovechamiento data desde la época precolombina. México es el área con mayor diversidad de plantas de Agave spp., en todo el mundo, con 159 de un total de 210 especies, de las cuales 119 son endémicas (García, 2012). Las plantas de maguey se encuentran en planicies, montañas, acantilados, dunas costeras o en los picos montañosos, preferentemente entre los mil y dos mil metros de altitud (García, 2007). El género Agave se encuentra en la familia Agavaceae e incluye especies de plantas adaptadas a condiciones de aridez. Tienen forma característica de roseta y poseen raíces ramificadas, cutícula gruesa, hojas suculentas con estomas hundidos y metabolismo fotosintético tipo CAM (Metabolismo Ácido Crasuláceo). El género Agave cuyo significado es “noble” o “admirable”, fue dado a conocer por C. Lineo en 1793 (Háuad-Marroquín et al., 2010).

The Agave spp. plants, also known as magueyes, have been exploited by man for ages. Its growth and use dates from the pre-Columbian times. Mexico is the area with the major diversity of Agave spp. plants from the entire world, with 159 from a total of 210 species, from which 119 are endemic (Garcia, 2012). Maguey plants are found in flatlands, mountains, cliffs, coast dunes or in mountain peaks, usually between one thousand and two thousand meters height (Garcia, 2007). The Agave genus is found in the Agavaceae family and it includes species of adapted plants in aridity conditions. Their characteristic shape is of a rose and they have ramified roots, thick cuticle, succulent leaves with sunken stomata and photosynthetic metabolism type CAM (Crassulacean Acid Metabolism). The Agave genus, which means “noble” or “admirable”, was described by C. Lineo in 1793 (Hauad-Marroquin et al., 2010).

La composición general de la planta de agave es: humedad 60 %, carbohidratos 25 %, fibra y medula 10 %, sales minerales 2.5 % y 2.5 % de otros componentes como proteínas e inulinas (Ibarra-Hernández, 2010). Cabe destacar que el polisacárido predominante en esta planta es la inulina, que representa entre un 85 y 90 % de los carbohidratos (Ibarra-Hernández, 2010).

The general composition of the agave plant is: 60 % humidity, 25 % carbohydrates, 10 % fiber and medulla, 2.5 % mineral salt 2.5 % and 2.5 % of other components such as proteins and inulin (Ibarra-Hernandez, 2010). It is worth mentioning that the predominant polysaccharide in this plant is the inulin, which represents between the 85 and 90 % of carbohydrates (Ibarra-Hernandez, 2010).

Las plantas de Agave han tenido una gran variedad de usos a través del tiempo, en la producción de bebidas alcohólicas como el tequila y el pozol, en la producción de alimentos como aguamiel, jugo dulce, jarabes, vinagre, atole, guisos, saborizantes y forraje (Gobierno del Estado de Hidalgo: Museo Nacional de Culturas Populares, 1988). La fibra de las plantas de Agave spp., también puede ser utilizada en la fabricación de hilos, cordeles, tejido para costales, bolsas, mantas, tapetes, morrales, sandalias, cinchos, hamacas y petates, entre otros. Actualmente, su principal uso es la producción de bebidas alcohólicas destiladas. Toda la planta de Agave puede ser aprovechada de manera integral, sin embargo, y aún en la industria de las bebidas alcohólicas, la fibra vegetal de desecho puede ser reutilizada (Huitron et al., 2008).

Agave plants have had a great variety of use throughout time, in the production of alcoholic beverages such as tequila and pozol, in the production of food such as maguey juice, sweet juice, vinegar, atole, stew, flavorings and fodder (Hidalgo State Government: National Museum of Popular Cultures, 1988). The fiber of the Agave spp. lumps can also be used in the making of thread, cord, sack weave, bags, blankets, rugs, satchels, sandals, girdles, hammocks and bed rolls, amongst others. All of the Agave plant can be used integrally, however, and even in the industry of alcoholic beverages, the waste vegetable fiber can be reused (Huitron et al., 2008).

Los residuos de las plantas de Agave spp., se acumulan en diferentes etapas de la producción de las bebidas alcohólicas; durante el proceso de “jimado”, donde se remueven las hojas del tallo, y después del cocimiento de las piñas donde los bagazos son desechados después de la fermentación. Aproximadamente un millón de toneladas de plantas de Agave tequilana Weber var. Azul son procesadas anualmente por la industria tequilera mexicana, generando residuos agrícolas (Huitrón et al., 2008), y la industria del mezcal también genera de 15 a 20 kg de bagazo por litro (Chávez, 2010). Si estos residuos no son reciclados o procesados apropiadamente se genera contaminación. Los subproductos generalmente son quemados o vertidos en basureros. Esto último plantea problemas debido a la liberación de CO₂, contaminación por presencia de olores, proliferación de ratas, moscas y otros insectos. Algunos de estos materiales son susceptibles de ser reutilizados por su alto contenido de azúcares, pigmentos, fibra alimentaria, proteína, polifenoles, lignina, entre otros compuestos. De esta forma, se conocen ejemplos de su utilización en la preparación de alimentos, remedios de salud, construcción, forrajes, fertilizantes, y como combustibles (Barragán-Huerta et al., 2008), todos ellos ejemplos de utilización directa de baja tecnología. Finalmente, estos residuos se han tratado de utilizar como sustratos para la aplicación de enzimas inulinasas de microorganismos como Aspergillus niger CH-A-2010 y CH-A-2016 (Huitrón et al., 2008). Esto aumenta el valor de los subproductos de Agave spp., y hacen más rentable, por lo tanto atractiva, su aplicación en la elaboración de enzimas, proteína unicelular, pigmentos y antibióticos.

The residuals from the Agave spp. plants are accumulated in different stages of the production of alcoholic beverages; during the “jimado” process, where the leaves are removed from the stem, and then after the cooking of the pines, where the chaff is thrown away after the fermentation. Approximately one million of tons of plants of Agave tequilana Weber var. Azul are processed annually by the Mexican tequila industry, generating agricultural residuals (Huitron et al., 2008), and the mescal industry generates from 15 to 20 kg of chaff per liter (Chavez, 2010). If such residuals are not recycled properly, contamination is generated. The subproducts are generally burned or thrown in trash collectors, which can carry problems due to the release of CO₂, pollution due odor presence, rat proliferation, flies and other insects. Some of these materials are apt to be reused by its high content of sugar, pigments, food fiber, polyphenols and lignin, among others. This way, examples of its utilization in the preparation of food, health remedies, construction, fodders, fertilizers and fuels are known (Barragan-Huerta et al., 2008), all of them examples of direct utilization of low technology. Finally, there has been an attempt to use these residuals as substrate for the application of inulinases enzymes of microorganisms such as Aspergillus niger CH-A-2010 and CH-A-2016 (Huitrón et al., 2008). Such situation increases the value of the Agave spp. subproducts and makes its application more profitable hence more attractive for the elaboration of enzymes, unicellular protein, pigments and antibiotics.

Los fructooligosacáridos (FOS) son carbohidratos compuestos formados por monómeros de fructosa con muy pocos residuos de glucosa casi siempre al final de la cadena; también son conocidos como fructanos. Si las fructosas presentan una unión predominante o exclusiva a través del enlace β-(2-1)-fructosil-fructosa reciben el nombre genérico de inulina, derivado de la planta Inula helanium ó bien si presentan enlaces β-(2-6) fructosil-fructosa reciben el nombre de levano (Figura 1A). La naturaleza de los enlaces tiene implicaciones bioquímicas; por ejemplo, la estructura lineal de los fructanos permite que sean solubles en agua, también le confiere a la planta resistencia a sequía y a los cambios de temperatura (Chacon-Villalobos, 2006).

The fructooligosaccharides (FOS) are composed carbohydrates formed by fructose monomers with very few glucose residuals, generally at the end of the chain; they are also known as fructans. If fructose presents a predominant or exclusive union through the bond β-(2-1)-fructosil-fructose, it receives the generic name of inulin, derived from the plant Inula helanium or, if it presents bonds β-(2-6) fructosil-fructose, it receives the name of levane (Figure 1A). The nature of bonds has biochemical implications; for example, the lineal structure of fructans allows them to be water soluble, and it also grants the plant resistance to drought and temperature changes (Chacon-Villalobos, 2006).

La inulina es un polímero formado por fructanos unidos por enlaces β-(2-1)-fructosil-fructosa y una glucosa terminal con enlace α-(1-2)-(D-glucopiranosil) (Figura 1B). Estos fructanos se encuentran generalmente como un carbohidrato de almacenamiento en las raíces, tubérculos y rizomas de ciertas plantas como la “tupinambo” (Helianthus tuberosus), la achicoria (Cichorium intybus) y la dalia (Dahlia spp.) (Singh et al., 2007). En la inulina, las unidades de fructosas enlazadas a la glucosa terminal puede variar desde algunas pocas unidades hasta 70, lo que significa que la inulina es una mezcla de oligómeros y polímeros, definiéndose como un polifructano con grado de polimerización (DP) mayor a 30 unidades (Castillo y Chamy, 2010).

Los fructanos como la inulina representan el segundo mecanismo más común de almacenamiento de energía después del almidón, y pueden ser producidos por bacterias Streptoccocus, Leuconostoc, Lactobacillus, Weissella; Zymomonas mobilis, Gluconacetobacter diazotrophicus, Bacillus subtilis y Bacillus polmyxa (Muñoz-Gutiérrez et al., 2009).

La inulina es una fibra soluble que el cuerpo no es capaz de digerir y por tanto promueve los movimientos intestinales, favoreciendo la eliminación de toxinas; es un potente estimulador del crecimiento de la flora intestinal benéfica, ayuda en la correcta asimilación de nutrientes como calcio y magnesio, mantiene los niveles de colesterol bajos y evita la acumulación de triglicéridos, su aporte de energía y nutrientes es mínimo, y es por esta particularidad que es recomendable en las dietas (Madrigal y Sangronis, 2007). En la actualidad, la presencia de ciertas cantidades de inulina en la formulación de un producto alimenticio es una condición suficiente para que dicho producto sea considerado como “alimento funcional”, que por definición sería aquel que contiene un componente o nutriente con actividad selectiva beneficiosa, lo que le confiere un efecto fisiológico adicional a su valor nutricional (Madrigal y Sangronis, 2007).

Inulin is a polymer formed by fructans joint by bonds β-(2-1)-fructosyl-fructose and a terminal glucose with bonds α-(1-2)-(D-glucopyranosyl) (Figure 1B). These fructans are generally found as storage in the roots, tubers and rhizomes of certain plants as the “tupinambo” (Helianthus tuberosus), the chicory (Cichorium intybus) and the dahlia (Dahlia spp.) (Singh et al., 2007). In the inulin, the units of fructose bond to terminal glucose can vary from very few units up to 70, which means that inulin is a mixture of oligomers and polymers, defining it as a polyfructane with polymerization grade (DP) higher than 30 units (Castillo and Chamy, 2010).

Fructans such as inulin represent the second most common mechanism of energy storage after starch, and can be produced by bacteria Streptoccocus, Leuconostoc, Lactobacillus, Weissella; Zymomonas mobilis, Gluconacetobacter diazotrophicus, Bacillus subtilis y Bacillus polmyxa (Muñoz-Gutiérrez et al., 2009).

Inulin is a soluble fiber that the body cannot digest and, therefore, it promotes intestinal movement, favoring the elimination of toxins; it is a strong stimulator of the growth of the beneficial intestinal flora, it helps in the correct assimilation of nutrients such as calcium and magnesium, keeps cholesterol levels low and avoids accumulation of triglycerides; its energy and nutrients supply is minimum, which makes it recommendable for dieting (Madrigal and Sangronis, 2007). Nowadays, the presence of certain amounts of inulin in the formulation of a food product is condition enough for it to be considered as “functional food”, by definition the one that contains a component or nutrient with beneficial selective activity, which grants it an additional physiological effect to its nutritional value (Madrigal and Sangronis, 2007).

Debido al alto costo de la inulina, entre 3 y 4 dólares por kilo (CUCEA IDIT pyme, 2013), se pretende utilizar fuentes de inulina más económicas y renovables para la producción de bioetanol, inulooligosacáridos y jarabe de fructosa (Castillo y Chamy, 2010). La inulina puede ser hidrolizada de dos maneras: mediante la hidrólisis química o la producción enzimática de microorganismos. La hidrólisis química se lleva a cabo por el proceso de hidrólisis ácida, aunque este método produce sustancias de color no deseado debido a la formación de difructosa anhídrida, este compuesto carece de propiedades edulcorantes (Singh y Gill, 2006). Por esta razón, la producción de inulina por medio de la utilización de la enzima inulinasa es más recomendable, con rendimientos de hasta 95 % de fructosa pura (Chi et al., 2009). Esta fructosa se encuentra en los tejidos vegetales formando oligosacáridos de diferente estructura molecular, lo que le confiere propiedades biológicas tanto de resistencia al estrés en la planta como en su potencial prebiótico y funcional en el humano (Madrigal y Sangronis, 2007).

La inulina está presente en más de 36,000 plantas pertenecientes a 10 familias (Chi et al., 2011) y es almacenada tanto en las partes aéreas como subterráneas. La extracción de inulina de la parte aérea (vegetativa) de las plantas (por ejemplo en la familia Gramineae) no es recomendada debido a sus bajos rendimientos de extracción a nivel industrial (Madrigal y Sangronis, 2007). Por lo anterior, las partes subterráneas son las más utilizadas para la producción industrial, siendo las dos principales el tupinambo (Helianthus tuberosus) y la achicoria (Cichorium intybus), aunque también se puede obtener de la raíz de dalia (Dahlia spp), la cebolla (Allium cepa L), el ajoporro (Allium porro L), el ajo (Allium sativum), el yacón (Smallanthus sonchifolius) y el espárrago (Asparragus officinalis L). La inulina también puede extraerse de la parte aérea (piñas) de plantas de Agave spp., principalmente de A. tequilana Weber var. Azul (Madrigal y Sangronis, 2007).

Uno de los usos novedosos del agave es la producción de jarabes de alta fructosa, siendo el más común el jarabe de agave azul (A. tequilana Weber var. Azul). Según la norma Mexicana NMX, 2008 (NMX-FF-110-SCFI-2008) se establecen las especificaciones del producto denominado Jarabe de Agave 100 % o Jarabe 100 % de Agave destinado a su comercialización en territorio de los Estados Unidos Mexicanos. El jarabe de agave azul es una sustancia dulce natural producida por la hidrolisis de fructanos y no debe contener aditivos alimentarios, almidones, melazas, glucosa, dextrinas, fructosa u otros azucares de origen diferente. Para la elaboración del Jarabe de Agave, no se permiten las mezclas de diferentes tipos de agaves y además debe cumplir con las especificaciones fisicoquímicas establecidas en la norma NMX, 2008 (NMX-FF-110-SCFI-2008) donde el porcentaje de azúcares reductores debe llegar a un mínimo de 90 % con 80 % de fructosa, y con un número (UFC g-¹) máximo bacteriano de 100 (con ausencia de coliformes), y de hongos y levaduras <10, respectivamente.

La bioconversión de la biomasa vegetal en azúcares fermentables utiliza una amplia gama de enzimas microbianas, tales como celulosas, xilanasas, pectinasas, e inulinasas (Huitron et al., 2008). En el caso de los fructanos de A. tequilana (ATF), la agavina (Figura 1C) contiene una estructura nueva de inulina donde los residuos de glucosa están en el interior de la cadena ramificada, combinando los dos tipos de enlaces (β-2,1 y β-2,6) y teniendo un grado de polimerización que va desde los 3 a los 29 monómeros, estos factores van cambiando en función de la edad de la planta, los ATF pueden ser degradados por fructosidasas para la optimización de los procesos de obtención de fructanos y fructosa libre (Arrizon et al., 2011).

One of the new uses of agave is the production of high fructose syrups, the most common the one from agave azul (A. tequilana Weber var. Azul). The Mexican Norm NMX, 2008 (NMX-FF-110-SCFI-2008) established the specifications of the product named Agave Syrup 100 % or Syrup 100 % Agave intended for commercialization in the United States of Mexico. The agave azul syrup is a natural sweet substance produced by the hydrolysis of fructans and must not contain food additives, starches, molasses, glucose, dextrins, fructose or any other sugar from diverse origin. For the elaboration of the Agave Syrup, mixes from different types of agave are not allowed. Apart from that, it must fulfill the physical-chemical specifications established in the NMX, 2008 (NMX-FF-110-SCFI-2008) where the percentage of reductive sugars must reach a minimum of 90 % with 80 % of fructose and a maximum bacterium number 100 (UFC g-¹), coliform absent, and from fungus and yeast <10, respectively.

The bioconversion of the vegetal biomass in fermentable sugars uses a wide range of microbian enzymes, such as celluloses, xylanase, pectinase and inulinases (Huitron et al., 2008). In the case of fructans from A. tequilana (ATF), agavin (Figure 1C) contains a new structure of inulin where the glucose residual is in the interior of the ramified chain, combining both types of bonds (β-2,1 and β-2,6), and having a polymerization grade that ranges from the 3 up to the 29 monomers; such factors change in function of the plant’s age, the ATF can be degraded by fructosidase for the optimization of the fructans and free fructose obtaining processes (Arrizon et al., 2011).

Fructanases

Las fructanasas son las enzimas responsables de hidrolizar los enlaces (β-2-1 o β-2-6) de los fructanos para liberar fructosa (Muñoz-Gutiérrez et al., 2009). Dentro de éstas se pueden encontrar a las β-fructosidasas no específicas, mismas que pueden hidrolizar fructanos desde su extremo reductor β-2-1 o β-2-6. Algunos ejemplos de éstas son la: exo-β-fructosidasas (exoinulinasas y exolevanasas) (EC. 3.2.1.80) y 2,6-β-fructano-6-levanobiohidrolasas (EC. 3.2.1.64). Estas enzimas también incluyen a las Endoinulinasas (EC. 3.2.1.7), las cuales hidrolizan específicamente los enlaces internos β-2-1 de la inulina. Finalmente, estas enzimas incluyen también a las Endolevanasas (EC. 3.2.1.65) que hidrolizan específicamente los enlaces internos β-2-6 en el levano (Muñoz-Gutiérrez et al., 2009).

Particularmente, las inulinasas incluyen enzimas β-fructosidasas no específicas como las exo-β-fructosidasas (exoinulinasas) (EC. 3.2.1.80) y enzimas con actividad 2,1-β-D-fructan-fructano hidrolasa (EC. 3.2.1.7). Estas enzimas pueden ser utilizadas para la producción de jarabes de alta fructosa y de oligofructanos, estos últimos han despertado el interés debido a su aplicación como ingrediente funcional (Golunski et al., 2011). Para su aplicación en la industria de alimentos y bebidas, las enzimas microbianas requieren un cierto grado de purificación. El aislamiento y la purificación de una enzima producida por microorganismos es una tarea difícil, teniendo en cuenta tanto los aspectos económicos como técnicos, ya que las etapas de purificación pueden llegar a un 70 o 90 % de los costos totales de producción. La purificación de una enzima a partir de un medio de fermentación por lo general implica una combinación de técnicas que separan las enzimas de acuerdo a su tamaño, carga, hidrofobicidad o capacidad para unirse a ciertos compuestos (Golunski et al., 2011). Para la optimización de la hidrólisis de ATF, se han realizado algunos estudios desarrollando procesos enzimáticos para reducir el consumo de energía y para aumentar la recuperación de azúcar (Muñoz-Gutiérrez et al., 2009). Por lo tanto, es necesaria la selección de enzimas con especificidad a ATF debido a su grado de ramificaciones para la aplicación industrial. Las levaduras de la especie K. marxianus son productoras de inulinasas que presentan una mejor actividad utilizando ATF como sustrato en comparación con la enzima comercial Fructozyme® (Arrizon et al., 2011). Aunado a esto, la capacidad de las enzimas para discriminar entre diferentes estructuras de fructanos también puede ser utilizada para caracterizar los cambios en la especificidad derivada de mutaciones. Para caracterizar completamente la especificidad y la cinética de las fructosidasas, es importante estudiar su actividad utilizando diferentes sustratos. Cabe destacar que el grado de ramificación es un factor importante para la actividad enzimática, pues la mayoría de los fructanos tienen un grado de ramificación diferente y éste determina la velocidad en la que actúan. Las aplicaciones industriales de estas enzimas, sin embargo, sólo serán factibles si estuvieran disponibles a un precio competitivo.

La producción de inulinasas se ve afectada por los componentes del medio y el tipo del organismo utilizado para la fermentación. Para compensar el costo de la inulina grado reactivo, diversos materiales vegetales se emplean en el enriquecimiento del medio (Chand et al., 2012). De ahí el interés por su estudio para producirlas, purificarlas y caracterizarlas a partir de cultivos microbianos en medios sintéticos, siendo la levadura K. marxianus la más estudiada (Castillo y Chamy, 2010). Recientemente se han publicado estudios de producción de inulinasa por fermentación de K. marxianus en extractos de yacón, de espárragos y de tubérculos de dalia, con rendimientos de actividad enzimática.

Fructanases are enzymes responsible of hydrolyzing the bond (β-2-1 or β-2-6) from the fructans to release fructose (Muñoz-Gutiérrez et al., 2009). With in the latter we can find non-specific β-fructosidases, which can hydrolyze fructans from their extremer reducer β-2-1 or β-2-6. Some examples are: exo-β-fructosidases (exoinulinases and exolevanases) (EC. 3.2.1.80) and 2,6-β-fructane-6-levanobiohidrolases (EC. 3.2.1.64). These enzymes also include endoinulinasas (EC. 3.2.1.7), which specifically hydrolyze internal bond β-2-6 in the levan (Muñoz-Gutiérrez et al., 2009).

Particularly, inulinases include non-specific β-fructosidases enzymes such as exo-β-fructosidases (exoinulinases) (EC. 3.2.1.80) and enzymes with activity 2,1-β-D-fructan-fructane hydrolase (EC. 3.2.1.7). These enzymes can be used in the production of high-fructose syrups and oligofructans, which have raised interest due to their application as functional ingredient (Golunski et al., 2011). For its application in the industry of food and beverages, microbial enzymes require certain grade of purification. The isolation and purification of an enzyme produced by microorganisms is not an easy task, taking into account both economical and technical aspects, since the purification stage can reach the 70 or 90 % from the total cost of production. The purification of an enzyme from a fermentation method generally implies a combination of techniques that separate enzymes according to its size, load, hydrophobicity or capacity to join certain compounds (Golunski et al., 2011). Several studies developing enzymatic processes to reduce the consumption of energy and to increase sugar recovery have been made in order to optimize the hydrolysis of ATF (Muñoz-Gutiérrez et al., 2009). Therefore, the selection of enzymes with specificity ATF is necessary due to its grade of ramifications for the industrial application. The yeasts of the K. marxianus species are producers of inulinases that present better activity using ATF as substrate in comparison to the commercial enzyme Fructozyme® (Arrizon et al., 2011). Furthermore, the capacity of enzymes to discriminate between different structures of fructans can also be used to characterize the changes in the derived specificity of mutations. In order to characterize completely the specificity and kinetic of fructosidases, it is important to study their activity by using different substrates. The ramification grade is an important factor for the enzymatic activity, since most of fructans have a different grade of ramification and this determines the velocity in which they act. However, the industrial applications in these enzymes would only be possible if they were at a competitive price.

The production of inulinases is affected by the components in the environment and the type of organism used for fermentation. In order to compensate the cost of the inulin reactive grade, diverse vegetal materials are used in the enrichment of the environment (Chand et al., 2012). In such situation lies the interest of their study to produce, purify and characterize them from microbial culture in synthetic environments, being the yeast K. marxianus the most studied (Castillo and Chamy, 2010). Recently, production studies of inulinase through fermentation of K. marxianus in yacon, asparagus and dahlia tuber extracts with enzymatic activity performances, have been published.

La selección de un microorganismo adecuado es un aspecto importante para producción de enzimas. El microorganismo debe ser capaz de crecer abundantemente de preferencia, y estar clasificado como GRAS y ser aceptado por la FDA (Food and Drug Administration) de los Estados Unidos de Norteamérica (Mazutti et al., 2006). Cepas de mohos, levaduras y bacterias son capaces de producir inulinasas y varias de ellas han sido cultivadas con éxito, y la enzima extraída, concentrada y purificada. Los microorganismos más comúnmente utilizados para la producción de inulinasa son las cepas de mohos como el Aspergillus spp. y levaduras como Kluyveromyces spp. (Castillo y Chamy, 2010). Esta última es especialmente adecuada para la aplicación industrial por dos motivos, el primero es su velocidad de crecimiento y el segundo es su habilidad de crecer en temperaturas de hasta 52 °C, lo que indica que es termotolerante y puede ser utilizada a escala industrial, además de tener capacidad de asimilar diferentes azúcares y de secretar enzimas líticas al medio. A continuación (Tabla 1) se observan algunos microorganismos con actividad inulinasa y dos de los factores fisicoquímicos más importantes (pH y temperatura) optimizados en cada caso.

The selection of an adequate microorganism is an important issue for enzyme production. The microorganism must be capable of preferably growing abundantly, and be classified as GRAS and being accepted by the FDA (Food and Drug Administration) of the United States of America (Mazutti et al., 2006). Fungi, yeast and bacterial strains are capable of producing inulinases and several of them have been cultivated with success, and the enzyme extracted, concentrated and purified. The most commonly used microorganisms for the production of inulinases are the fungi strains such as Aspergillus spp. and yeasts such as Kluyveromyces spp. (Castillo and Chamy, 2010). The latter is especially adequate for industrial application for two reasons: the first its growth velocity and the second its ability to grow in temperatures of up to 52 °C, which indicates that it is thermotolerant and can be used in industrial scales, besides of having the capacity to assimilate different sugars and secrete lytic enzymes to the environment. In Table 1 some microorganisms with inulinase activity and two of the most important physicochemical factors (pH and temperature), optimized in each case, are observed.

La levadura K. marxianus fue descrita por primera vez en 1888 por E.C. Hansen, que en esos momentos se llamaba Saccharomyces marxianus en honor a Marx, quien aisló originalmente esta levadura a partir de uvas. Esta levadura forma colonias butirosas de color blanco a cremoso, su reproducción es vegetativa por gemación, con facilidad para elaborar pseudohifas, con ascas evanescentes que contienen hasta 4 ascosporas lisas que pueden ser redondas, ovaladas o reniformes; no se conjuga o esto ocurre de célula a célula o de célula a gemación, tanto en agar YM como en agar de acetato de McClary. La levadura K. marxianus ha sido aislada de una gran variedad de ambientes, que van desde productos lácteos, bebidas fermentadas, material vegetal en descomposición, efluentes residuales diversos, hasta tejidos humanos infectados (Barnett et al., 2000). Esto nos hace suponer que para sobrevivir en estos ambientes debe darse la producción de enzimas tales como β-galactosidasas, β-glucosidasas, inulinasa y poligalacturonasas por mencionar algunas.

Otras de las características tecnológicas interesantes de K. marxianus es que es capaz de producir compuestos aromáticos y etanol (incluidos los procesos de sacarificación - fermentación simultáneas de alta temperatura); al igual que se ha reportado la reducción del contenido de lactosa en los productos alimentarios, producción de ingredientes de especialidad a partir de suero de leche, biorremediación, como agente reductor del colesterol, y como hospedero para la producción de proteínas heterólogas (Fonseca et al., 2008).

La levadura K. marxianus se ha estudiado parcialmente a nivel molecular y ha sido adoptada por la industria para aplicaciones que van desde la producción de biomasa hasta la biorremediación; las aplicaciones industriales que se le dan a esta levadura van de acuerdo con sus propiedades de crecimiento acelerado, su capacidad termotolerante y su producción ó secreción de enzimas, así como su producción de etanol en menor medida (Lane et al., 2011). Muchas de las aplicaciones de K. marxianus están basadas en su capacidad de producir etanol con azúcares específicos tales como inulina o lactosa.

Una manera de hacer más eficiente y rentable el procesamiento mediante enzimas es su inmovilización. A este respecto, las inulinasas pueden ser inmovilizadas y mantener el 90 % de su actividad original después de ser incubadas a 60 °C por 3 h. en contraste con su forma libre, donde se observan pérdidas de hasta el 10 % de su actividad en las mismas condiciones, esto debido a que al inmovilizar la inulinasa se mejora su estabilidad térmica en 5 °C según Singh y Lotey (2010). Estos investigadores reutilizaron la enzima en 55 corridas, de éstas en el cuarto ciclo se perdió un 10 % de su actividad, en el ciclo 7 se perdió un 20 % y después de esto se mantuvo una pérdida constante de hasta el 50 % de su actividad en la corrida 23, probando un aumento en la producción de fructanos producidos, en el estudio también se demostró que no hay diferencia si se utiliza inulina grado reactivo o inulina de fuentes naturales como la raíz de tupinambo (Singh y Lotey, 2010). Esto indica que se podría utilizar inulina proveniente de residuos agroindustriales para la producción de fructanos.

The yeast K. marxianus was described for the first time in 1888 by E.C. Hansen, which by the time was called Saccharomyces marxianus in honor to Marx, who originally isolated this yeast from grapes. This yeast forms butyrose colonies of white to cream color; its reproduction is vegetal by budding, with facility to elaborate pseudophyphae, with evanescent ascii that contain up to 4 smooth ascospores that can be round, oval or kidney-shaped; it does not conjugate or it happens from cell to cell or from cell to bud, both in agar YM as well as in acetate McClary agar. The yeast K. marxianus has been isolated from a great variety of environments that range from dairy, fermented drinks, vegetal material in decomposition, diverse effluent residuals to infected human tissues (Barnett et al., 2000). Hence, in order to survive in these environments, the production of enzymes such as β-galactosidases, β-glucosidases, inulinase and polygalacturonases, only for mentioning some, must take place.

Other interesting technological characteristics of the K. marxianus are its ability to produce aromatic composes and ethanol (included in the processes of simultaneous sacarification – fermentation of high temperature); as the reduction of content of lactose in food products, the production of ingredients of specialty from whey, bioremediation, as cholesterol lowering agent and as host for the production of heterologous proteins, has been reported (Fonseca et al., 2008).

The yeast K. marxianus has been partially studied in a molecular level and has been adopted by the industry for applications that go from the production of biomass to the bioremediation; industrial applications given to this yeast agree on its accelerated growth properties, its thermotolerant capacity and its production or secretion of enzymes, as well as its production of ethanol in minor range (Lane et al., 2011). Many of the applications of K. marxianus are based in its capacity to produce ethanol in different and specific sugar, such as inulin and lactose.

One way to make the enzyme process much more efficient and proficient is its immobilization. Regarding the latter, inulinases can be immobilized and keep 90 % of their original activity after being incubated at 60 °C by 3 h. in contrast with its free form, where losses of up to 10 % of its activity in the same condition are observed, due to the fact that when the inulinase is immobilized its thermal stability improves according to Singh and Lotey (2010). In the latter, the enzyme was reused in 55 runs, from these, in the 4 cycle 10 % of its stability was lost, in the 7 cycle 20 % and after that, a constant loss was kept of up to 50 % of its activity in the 23 run, proving an increase in the production of the fructanes produced. It was also proved that there is no difference in the use of reactive grade inulin or natural source inulin such as the artichoke root of Jerusalem (Singh and Lotey, 2010). This indicates that inulin that comes from agroindustrial residuals could be used for the production of fructanes.

Los desechos de la industria del Agave poseen características de composición que permiten su utilización como fuentes de carbono para microorganismos productores de inulinasas. Debido a los beneficios a la salud, y a la importancia que están tomando los productos provenientes de los oligofructanos, es necesaria la optimización de la producción de estas enzimas. La levadura K. marxianus ha demostrado ser un microorganismo de alta resistencia a condiciones de proceso y capacidad metabólica para utilizar productos naturales de inulina para la optimización y reducción de los costos de producción de estas enzimas. Debido a la complejidad de los sustratos utilizados, es necesario realizar más investigaciones tanto para la búsqueda de nuevas cepas productoras de inulinasas, optimizar el uso de los residuos agroindustriales, y encontrar sistemas de reutilización de las enzimas como lo es la inmovilización de las mismas, con el fin de poder incidir efectivamente en el aprovechamiento de toda la cadena productiva del agave.

The waste in the industry of Agave possesses characteristics of composition that allow its use as source of carbon for microorganisms producing inulinases. Due to the benefits for health and the importance that products coming from oligofructanes have, the optimization in the production of these enzymes is necessary. The yeast K. marxianus has proven to be a high resistant to process conditions and metabolic capacity microorganism to use natural inulin products for the optimization and reduction in the costs of production of these enzymes. Due to the complexity of the substrates utilized, it is necessary to run further investigations for the search of new producing strains of inulinases, optimizing the use of agroindustrial waste, as well as for finding reutilization systems of enzymes such as their immobilization, in order to effectively influence in the exploitation of all the productive chain of agave.

Los autores agradecen el apoyo del proyecto FOMIX Tamaulipas 193682, al Instituto Politécnico Nacional (proyectos SIP2014-4029 y SIP2014-4002) y al CONACyT por la beca a S.A.H.A.

The authors wish to thank the support of project FOMIX Tamaulipas 193682, the Instituto Politécnico Nacional (projects SIP2014-4029 and SIP2014-4002) and CONACyT for the scholarship to S.A.H.A.