REVISTA BIO CIENCIAS

PALABRAS CLAVE

KEY WORDS

Enraizamiento, menta, propagación, vitroplantas

Mint, propagation, rooting, vitroplants

RESUMEN

ABSTRACT

El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar dos metodologías de producción de plantines de menta (Mentha arvensis L.) a través de micropropagación y macropropagación por esquejes. En micropropagación, se evaluaron en forma independiente ácido naftalenacético (ANA), indolbutírico (AIB) e indolacético (AIA) a 0.01, 0.1 y 1 mg L^-1. Se registró una contaminación del 8 %. El número de raíces presentó diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos. Se alcanzó una tasa de multiplicación de 1:8. Durante aclimatación el 100 % de los explantos sobrevivieron. En macropropagación, se evaluaron ANA, AIB y Nafusaku, a 10, 25 y 50 mg L^-1 respectivamente. Se logró el 100 % de enraizamiento en todos los tratamientos. En el sustrato perlita:arena:lombricompuesto (1:1:1), se logró un sistema radicular con más de 6 raíces mayores a 1 cm de longitud y mayor biomasa total.

This work aims to develop two mint (Mentha arvensis L.) seedling production methodologies through micropropagation and macropropagation cuttings. In micropropagation the auxins naphthalene acetic acid (NAA), indole butyric (IBA) and indole acetic acids (IAA) at 0.01, 0.1 and 1 mg L^-1 were evaluated independently. Contamination of 8 % was recorded. The number of roots presented statistically significant differences amongst the treatments. A 1:8 rate of multiplication was reached. A 100 % of the explants survived along acclimation. In macropropagation NAA, IBA and Nafusaku, at 10, 25 and 50 mg L^-1 respectively, were evaluated. A 100% rooting was scored in all treatments. In the substrate perlite: sand: earthworm compost (1:1:1), a root system with more than 6 roots larger than 1 cm in length and larger total biomass was achieved.

Introducción

Introduction

Los cultivos de plantas aromáticas y medicinales han sido considerados de gran interés social, cultural, culinario y medicinal, pero de escaso o nulo valor económico. Son cultivos con capacidad para generar empleo, valor agregado y para mejorar la economía local y regional. Actualmente en los países desarrollados la producción de especies aromáticas y medicinales ha descendido y el consumo y comercio han aumentado. Su cultivo representa una alternativa a la producción agrícola tradicional, ayudaría a frenar la migración del campo a la ciudad y generaría una nueva fuente de actividad económica.

La  Mentha arvensis L., es una planta perenne que no produce semillas, se reproduce por esquejes y es cultivada industrialmente por el aceite extraído de las hojas (mentol). Al momento de la cosecha se recolectan las plantas y se secan, luego el material seco pasa por un proceso de destilación para recuperar el aceite (Brown et al., 2003).  El mentol natural es extensamente utilizado en alimentación, en la industria farmacéutica y cosmética (Suresh et al., 2012). La producción mundial de mentol  se estima en alrededor de 20 000 t.  China, India, Brasil, Japón, Francia y Estados Unidos son los mayores productores de aceite esencial de Mentha arvensis L. Los importadores de mayor envergadura son Estados Unidos, Alemania y Japón (Srivastava et al., 2002).

Argentina, debido a su vasto territorio de recursos naturales y humanos, está en condiciones de posibilitar la producción de una amplia variedad de cultivos aromáticos. En el año 2012, se importaron en el país 230.3 t de menta (Cameroni, 2012). En la provincia de Salta (Argentina), el cultivo de menta (M. arvensis L.) tiene potencial para convertirse en una alternativa productiva viable para la región del Valle de Lerma y hasta de los Valles Calchaquíes (Arizio, 1999). En la zona se ha alcanzado rendimiento de aceite de calidad normal de hasta 90 Kg ha-1 en dos cortes (Camisa, 1990). Sin embargo, esta actividad aún está lejos de alcanzar su desarrollo potencial, debido a que es realizada por pequeños productores con poca información y tecnología; con bajos rendimientos y calidad. Uno de los principales obstáculos que enfrenta la actividad productiva es la carencia de material reproductivo con calidad genética para garantizar rendimientos y calidad de aceite.

Una de las posibles tecnologías que se pueden emplear para mejorar la producción de menta, es la obtención de plantines por métodos de propagación por esquejes (macropropagación) y micropropagación. La propagación por esquejes permite obtener un clon con las mismas características genéticas que la planta madre. Además es una técnica sencilla, rápida y de bajo costo; por lo tanto de fácil acceso, tanto para el pequeño productor como para el empresario. La micropropagación constituye uno de los métodos tecnológicos que mayores logros ha aportado al desarrollo de una nueva agricultura. Dentro de las innumerables ventajas que posee la micropropagación con respecto a la propagación convencional, se encuentran: el reducido espacio que se necesita para producir un importante número de plantas a partir de un explanto y la de asegurar la producción de plantas con sanidad controlada (sobre todo libre de virus) (Roca, 1991). La menta es una especie de fácil enraizamiento, por lo que es factible reproducirla de manera masiva y más rápida a través de micropropagación que por medios convencionales. El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar dos metodologías de producción de plantines de menta (M. arvensis L.) a través de micropropagación y macropropagación por esquejes, representando esta última una tecnología accesible para implementar por pequeños productores.

Aromatic and medicinal plant crops have been considered of great social, cultural, culinary and medicinal interest but in scarce or null economic value. They are crops of great capacity to generate labor, added value and to improve local and regional economies. Currently, in developed countries, production of aromatic and medicinal species has decreased and the consumption and commerce have increased. Its growth represents an alternative to traditional agricultural production, helping to stop migration from the fields to the city, and generating a new source of economic activity.

Mentha arvensis L., is a perennial plant that does not produce seeds; it reproduces through cuttings, it is industrially growth for the extracted oil from its leaves (menthol). At the moment of the harvest, plants are collected and then dried, the dried material is then put through a distillation process in order to recover the oil (Brown et al., 2003). Natural menthol is extensively used in feeding and in the pharmaceutic and cosmetic industries (Suresh et al., 2012). Worldwide production of menthol is estimated around 20 000 t. China, India, Brazil, Japan, France and the United States are the higher producers of essential oil of Mentha arvensis L. The most important importers are United States, Germany and Japan (Srivastava et al., 2002).

Due to its wide territory of natural and human resources, Argentina is in condition to enable the production of a great variety of aromatic crops. In 2012, 230.3 t of mint were imported (Cameroni, 2012). In the province of Salta (Argentina), the growth of mint (M. arvensis L.) has potential to become in a feasible productive alternative for the region of Valle de Lerma and up to the Valles Calchaquíes (Arizio, 1999). Performance of normal quality oil of up to 90 Kg ha-1 in two crop cuts has been reached in the zone (Camisa, 1990). Nevertheless, this activity is still far from reaching its potential development because it is performed by small producers, who lack information and technology, with low quality and performance. One of the main obstacles that the productive activity faces is the lack of reproductive material with genetic quality in order to guarantee yields and oil quality.

One of the possible technologies that can be applied to improve mint production is the obtaining of seedlings through propagation methods by cuttings (macropropagation) and micropropagation. Propagation through cuttings enables to obtain a clone with the same genetic characteristics as the mother plant. In addition, it is a simple, fast and low cost technique, therefore, readily available, for both the small producer and the businessman. Micropropagation constitutes one of the technological methods that has provided greater achievements to the development of new agriculture. Within the uncountable advantages that micropropagation possesses in respect with conventional propagation, we can find: the reduced space needed to produce an important number of plant from an explant and assuring the production of plants with controlled sanity (mainly virus free) (Roca, 1991). Mint is an easy rooting species, with micropropagation it is feasible to reproduce it massively and more quickly than with conventional means. This work aims to develop two production methodologies of mint seedlings (M. arvensis L.) through micropropagation and macropropagation by cuttings, the latter representing an accessible technology to be implemented by small producers.

Materiales y Métodos

Methods and Materials

I. Obtención de plantas madre

I. Obtaining of mother plants

Se emplearon esquejes de M. arvensis L. (menta japonesa) de 10 cm de longitud, seleccionados por ausencia de hojas necrosadas y sin síntomas de déficit hídrico, los cuales se enraizaron durante el mes de septiembre del año 2012 en invernaderos de la Cátedra de Fisiología Vegetal, de la Facultad de Ciencias Naturales-Universidad Nacional de Salta-Argentina (24°47´18”S  65°24´38” O). Se utilizaron canteros de 8 m2, revestidos con plástico negro de 100 micrones de espesor  y conteniendo un sustrato compuesto por suelo orgánico, turba, perlita y arena, en una proporción 1:1:1:1. Se efectuaron riegos manuales cada tres días. Las condiciones ambientales en esta etapa fueron de 60 % de humedad relativa (HR) y una temperatura promedio de  25 °C. Las plantas madres así obtenidas se trataron con Carbendazim en dosis de 1mL L^-1 y Cipermetrina a 1.5 mL L^-1, en pulverizaciones regulares cada 15 días, a fin de asegurar adecuadas condiciones sanitarias para los ensayos posteriores.

Cuttings of M. arvensis L. (Japanese mint) of 10 cm length, selected by absence of necrotic leaves and no symptoms of water deficit were used, which were rooted during September 2012 in greenhouses from the Department of Vegetal Physiology of Natural Sciences School – National University of Salta – Argentina (24°47´18”S  65°24´38” W). 8 m2 stonemasons were used, coated with black plastic of 100 microns thick and containing a substrate composed by organic soil, peat, perlite and sand, in a proportion 1:1:1:1. Manual watering were made every three days. Environmental conditions in this phase were 60 % relative humidity (RH) and an average temperature of 25°C. Obtained mother plants were treated with Carbendazim in 1mL L^-1 and Cypermethrin at 1.5mL L^-1 doses, in regular pulverizations every 15 days, in order to assure adequate sanitary conditions for posterior tests.

II. Ensayos de Micropropagación

II. Micropropagation tests

Para la obtención de los explantos en invernadero, se cortaron tallos de menta con cinco a seis nudos. En el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Facultad de Ciencias Naturales-Universidad Nacional de Salta-Argentina,  se seccionaron los segmentos nodales, un cm por encima y por debajo del nudo. Se realizaron dos desinfecciones. La primera con agua destilada mas cuatro gotas de Tween 20, bajo agitación durante 10 minutos, seguida por agua destilada mas PURSUE® (amonio cuaternario) al 25 % (V/V) bajo agitación durante 15 minutos y posterior lavado con agua corriente. La segunda desinfección se aplicó en cámara de flujo laminar en condiciones asépticas, la cual consistió en inmersión en alcohol 70 % durante un minuto, seguida por hipoclorito de sodio (NaOCl) al 5 % (P/V) + 4 gotas de Tween 20, durante 15 minutos y lavado reiterado con agua destilada estéril. Una vez concluido con los procesos de desinfección se llevó a cabo la siembra de los explantos. Para la siembra se empleó el medio de cultivo de Murashige y Skoog (MS, 1962) (Conger, 1987). Los medios fueron gelificados con 7 g L^-1 de agar – agar, adicionando 0.1 g L^-1 de myo-inositol y 30 g L^-1 de azúcar. El pH de los medios se ajustó a siete y se esterilizaron en autoclave, durante 20 minutos a 1.5 atmósferas de presión. Se analizó en forma independiente el efecto de tres auxinas: ácido naftalenacético (ANA), ácido indolbutírico (AIB) y ácido indolacético (AIA), en tres concentraciones (0.01; 0.1 y 1 mg L^-1) cada uno y se empleó un tratamiento testigo sin auxina. Una vez esterilizados los medios de cultivo, se procedió a la siembra de los explantos nodales. Los frascos con 20 mL de medio de cultivo conteniendo un explanto se dispusieron en estantes iluminados (36.15 mmol m^-2 s^-1) con fotoperíodo de 16 h y temperatura de 21 °C + 2 °C.

Después de dos semanas, se evaluó: porcentaje de contaminación, número de nudos, número de ramas, número de raíces y tasa de multiplicación (n° de nudos iniciales/n° de nudos finales) (Chamorro et al., 2007). A fin de caracterizar el sistema radicular, se procedió a realizar una clasificación cualitativa del mismo aplicándose el siguiente criterio de clasificación: Raíces escasas = 1-3 raíces mayores a un cm de longitud; Raíces medias = 4-6 raíces mayores a un cm de longitud y Raíces abundantes = mas de 6 raíces mayores a un cm de longitud. Se aplicó un diseño Completamente Aleatorizado (DCA) con 12 repeticiones por tratamiento, considerándose como unidad experimental un frasco con un explanto. Se utilizó el test de Tukey para la comparación de medias. La aclimatación de las vitroplantas se realizó bajo cámara húmeda a temperatura ambiente en bandejas conteniendo perlita. En esta etapa se evaluó el porcentaje de supervivencia.

To obtain the explants in the greenhouse, mint stems were cut from five to six nodes. In the Laboratory of Growth of Vegetal Tissue from the Natural Sciences School – National University of Salta – Argentina, nodal segments were selected one cm above and below the node. Two disinfections were made. The first one with distilled water plus four drops of Tween 20, under agitation during 10 minutes, followed by distilled water plus PURSUE® (quaternary ammonium) at 25 % (V/V) under agitation during 15 minutes followed by wash with tube water. Second disinfection was applied in laminar flow bench in aseptic conditions, which consisted of immersion in alcohol 70 % during one minute, followed by sodium hypochlorite (NaOCl) at 5 % (W/V) + 4 drops of Tween 20 during 15 minutes and repeated washing with sterile distilled water. Once the disinfection processes concluded, explant planting was performed. For the planting, the culture medium of Murashige and Skoog (MS, 1962) (Conger, 1987) was used. The mediums were gelled with 7 g L^-1 of agar – agar, adding 0.1 g L^-1 de myo-inositol and 30 g L^-1 of sugar. The pH of the mediums was adjusted at seven and sterilized by autoclaving during 20 minutes at 1.5 atmospheres of pressure. The effect of three auxins was analyzed independently: naphthalene acetic (NAA), indole butyric (IBA) and indole acetic acids (IAA), in three concentrations (0.01; 0.1 and 1 mg L^-1) each and a control treatment with no auxin was used. Once the culture mediums were sterilized, the planting of nodal explants followed. Bottles with 20 mL of culture medium containing an explant were placed in illuminated shelves (36.15 mmol m^-2 s^-1) with photoperiod of 16 h and temperature of 21°C + 2 °C. 

After two weeks, the following was evaluated: contamination percentage, number of nodes, number of branches, number of roots and multiplication rate (n° of initial nodes/n° of final nodes) (Chamorro et al., 2007). In order to characterize the rooting system, a qualitative classification of it was made by applying the next classification criteria: scarce Roots = 1-3 roots larger than a cm of length; medium Roots = 4-6 roots larger than a cm length and abundant Roots = more than 6 roots larger than a cm length. A Completely Randomized Design (CRD) was applied with 12 repetitions per treatment, considering one bottles of explant as experimental unit. Tukey test was used to compare measures. The acclimation of vitroplants was performed under humid chamber at room temperature in trays containing perlite. The percentage of survival was evaluated in this phase.

III. Ensayo de macropropagación de esquejes

III. Macropropagation test of cuttings

A partir de plantas madre con sanidad controlada se seleccionaron esquejes de aproximadamente 15 cm de longitud, las que se desinfectaron con Carbendazim a 1 mL L^-1, durante cinco minutos. Una vez desinfectadas, a fin de inducir el enraizamiento, se aplicaron ANA, AIB y un producto comercial conteniendo 4 g de ANA por 100 g de formulado, denominado Nafusaku ®. Se utilizaron para cada fitorregulador tres concentraciones diferentes (10, 25 y 50 mg L^-1), en todos los casos se empleó un tratamiento testigo, sin regulador de crecimiento. Cada tratamiento con 50 unidades experimentales, se replicó tres veces. Posteriormente, las estacas se plantaron en un microtúnel elevado, usando perlita como sustrato, bajo 80 % de HR y una temperatura promedio de  25 °C. Luego de dos semanas desde la plantación se evaluó el porcentaje de enraizamiento, aplicándose el mismo criterio de clasificación de raíces empleado en la etapa de micropropagación. Una vez definido el tratamiento en el cual se presentaron los más altos valores de la categoría de raíces abundantes, se analizó el efecto de cuatro sustratos en la rizogénesis: a) Perlita, b) Perlita + arena, (proporción 1:1), c) Perlita + lombricompuesto, (1:1) y d) Perlita + arena + lombricompuesto (1:1:1). Los esquejes fueron distribuidos en bandejas de 288 celdas, conteniendo los distintos sustratos. Se analizó Porcentaje de enraizamiento y biomasa total. Los ensayos se llevaron a cabo en un diseño en bloques completamente aleatorizado (DCA). En el análisis estadístico de la biomasa, se utilizó el test de Tukey para la comparación de medias.

From the mother plants with controlled sanity, cuttings of approximately 15cm length were selected and disinfected with Carbendazim at 1 ml L^-1 during five minutes. Once disinfected, to induce rooting, NAA, IBA and a commercial product containing 4 g of NAA per 100 g of formula named Nafusaku ® were applied. For each phytoregulator, three different concentrations were used (10, 25 and 50 mg L^-1), in all cases a control treatment was used with no growth regulator. Each treatment with 50 experimental units was replicated three times. Posteriorly, the cuttings were planted in an elevated microtunnel using perlite as substrate, under 80 % of RH and an average temperature of 25 °C. After two weeks from the planting, rooting percentage was evaluated by applying the same classification criteria of roots used in the micropropagation phase. Once the treatment in which the higher rates of abundant roots category was defined, the effect of four substrates in the rhizogenesis was analyzed: a) P = perlite, b) perlite + sand (proportion 1:1), c) perlite + earthworm compost (1:1) and perlite + sand + earthworm compost (1:1:1). The cuttings were distributed in trays of 288 cells, containing the different substrates. Rooting percentage and total biomass were analyzed. Tests were carried in a completely randomized block design (CRD). In the statistical analysis of biomass, Tukey test was used for the comparing of means.

Resultados y Discusión

Results and Discussion

I. Acondicionamiento de plantas madre

I. Preparation of mother plants

A los 45 días, se consiguió el establecimiento de los esquejes implantados en canteros. Los tratamientos sanitarios aplicados a las plantas madre fueron efectivos para el control de plagas y enfermedades, logrando en las mismas, condiciones apropiadas para la ejecución de los ensayos previstos. Las aplicaciones de agroquímicos redujeron la incidencia de contaminantes in vitro.

Within 45 days, the establishment of cuttings implanted in stonemasons was reached. Sanitary treatments, applied to mother plants, were effective for plague and disease control, achieving appropriate conditions for the execution of intended tests. Agrochemical applications reduced the incidence of in vitro contaminants.

II. Ensayo de micropropagación

II. Micropropagation Test

Se encontraron diferencias significativas (p<0.05) entre los tratamientos (2 intervalos y 3 alturas de corte) en el rendimiento de MS y PT (Tabla 1, Figura 1). En el periodo de 60 días y 40 cm de altura al corte, se observó queM. oleifera obtuvo los más altos rendimientos de MS (1.912 t ha^-1 corte^-1) y PT (0.416 t ha^-1 corte^-1), comparado con los demás tratamientos que oscilan, en el caso de la MS entre 0.705 y 1.610 y en la PT entre 0.156 y 0.332, t ha^-1 corte^-1, respectivamente. Estos resultados son coincidentes con la idea general, pero no concluyente, de que a mayor intervalo de corte, se incrementa el contenido de MS (Reyes, 2006). Por ejemplo, Reyes et al., (2006), correlacionaron el rendimiento de MS de M. oleifera con densidades de siembra e intervalos de corte, encontrando el más alto rendimiento de MS a los 75 días.

En contraparte, los datos de nuestra investigación no se asemejan al conocimiento generalizado de que a mayor altura de corte, el rendimiento de MS debe ser mayor. Esto es evidente, en la Tabla 2 donde se muestra el rendimiento promedio de forraje, al realizar la comparación múltiple entre intervalos y alturas al corte del experimento (p<0.05), en cuatro ocasiones de medición, en la cual se observa mejor respuesta en las plantas con 40 cm de altura (1.446 t MS ha^-1 corte^-1). Por lo tanto, se puede establecer que nuestros datos de rendimiento de MS son similares a los obtenidos por Petit et al., (2010), quienes, en un trabajo reciente realizado en Yucatán encontraron un rendimiento promedio de forraje de 1.2 t MS ha^-1 en un monocultivo de moringa y por los encontrados por Castellón y González (1996), en dos podas en Nicaragua (1.265 y 2.327 t MS ha^-1 corte^-1). Sería conveniente incluir un estudio posterior sobre el efecto de la densidad de siembra sobre el rendimiento de MS de esta especie en las condiciones propias del oriente de Yucatán para corroborar los resultados de la presente investigación (Gadzirayi et al., 2013). Por otro lado, no se encontraron diferencias estadísticas (p>0.05) entre las características agronómicas estudiadas: altura de la planta (cm), relación hoja-tallo (%), proteína cruda (%) y materia seca (%). No obstante, nuestros datos, representados en la Tabla 3, son superiores a los encontrados por Medina et al., (2007), por ejemplo, a los 60 días, la altura media de las plantas en el presente estudio fue de 1.80 m, en contraste con el 1.53 m al mismo tiempo de corte. Similarmente, Petit et al., (2010), encontraron una altura promedio de 1.0 m para moringa en su estudio en Yucatán. Por último, la media general de materia seca para plantas estudiadas fue de 20.8 %.

Significant differences were found (p<0.05) among treatments (2 intervals and 3 cutting heights) in the yield of DM and TP (Table 1, Figure 1). In the 60 day period and 40 cm height at cutting, it was observed M. oleifera obtained the highest yields of DM (1.912 t ha^-1 cutting-1) and TP (0.416 t ha^-1 cutting^-1), compared with the other treatments that oscillate, in the case of DM, between  0.705 and 1.610, and in TP between 0.156 and 0.332, t ha^-1 cutting^-1, respectively. These results coincide with the general idea, but not concluding, that at a higher cutting interval, the content of DM is increased (Reyes, 2006). For instance, Reyes et al., (2006) correlated the DM yield of M. oleifera with planting densities and cutting intervals, finding the highest yield of DM at 75 days.

In contrast, data from our investigation do not assemble the general knowledge that at higher cutting height, higher DM yield. This is evident in Table 2, where average yield of forage, when performing the first multiple comparison between intervals and heights at the end of the the experiment (p<0.05), in four times of measuring, in which better response is observed in plants with 40 cm height (1.446 t MS ha^-1 cutting^-1). Therefore, it can be established that our DM yielding data are similar with those obtained by Petit et al., (2010), who at a recent work performed in Yucatán found an average yielding forage of 1.2 t MS ha^-1 in monoculture of moringa and by the ones found by Castellon and Gonzalez (1996), in two prunings in Nicaragua (1.265 and 2.327 t MS ha^-1 cutting^-1). It would be convenient to include a posterior study on the effect of sowing density over the DM yield of these species under proper conditions in East Yucatan to corroborate the results of this investigation (Gadzirayi et al., 2013). On the other hand, no statistical differences were found (p>0.05) between the agronomic studied characteristics: plant height (cm), leaf-stem relation (%), crude protein (%) and dry matter (%). Nevertheless, our data, represented in Table 3, are superior to those found by Medina et al., (2007), for example, at 60 days, average height of planta in this study was 1.80 m, in contrast with 1.53 m at the same time of cutting. Similarly, Petit et al., (2010) found an average height of 1.0 m for moringa in their study in Yucatan. Finally, the average mean of dry matter for studied plants was 20.8 %.

II. Ensayo de micropropagación

II. Micropropagation Test

El protocolo de desinfección aplicado en laboratorio fue efectivo para el control de contaminantes, alcanzando un 92 % de asepsia. La contaminación registrada apareció a los cuatro días, correspondiendo un 43 % a bacterias y un 57 % a hongos. Un aspecto altamente promisorio para nuestra región, debido a que en otros lugares como México y Rumania la presencia de contaminantes endógenos limitan la aplicación de esta técnica (Héctor et al., 2005; Ionescu-Mălăncus et al., 2009). No se observó necrosamiento de los explantos, como consecuencia de la exposición a los agentes empleados, ni tampoco liberación de fenoles en el medio de cultivo. El análisis del número de nudos (valor promedio de 2.38) y número de ramas (valor promedio de 1.63), no arrojó diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos. El número de ramas es una característica que se mantiene independientemente del tratamiento aplicado. En el tratamiento sin auxinas se registró un promedio de 2.0 nudos/rama  y con la adición de auxinas a los medios de cultivo, aumenta hasta 2.63 nudos/rama lo cual incrementa la tasa de multiplicación. En otras especies como Vitex negundo (Kannan et al., 1998), Syzygium travancoricum (Anand et al., 1999), Ancistrocladus abbreviates (Bringmann et al., 1999) y Coleus blumeni (Rani et al., 2006), la utilización de ANA mejora la respuesta en el crecimiento de tallos cuando se utilizaron segmentos nodales. En este trabajo los segmentos nodales constituyen una adecuada fuente de explantos con excelente respuesta, observaciones similares han sido informadas para especies medicinales como Rauwolfia serpentine (Roy et al., 1995), Emblica officinalis (Rahaman et al., 1999), Holarrhena antidysenterica (Ahmed et al., 2001) y Enicostemma hyssopifolium (Seetharam et al., 2002).

En el número de raíces se detectaron diferencias estadísticamente significativas (F=2,54, gl=9 y p=0.01) entre los tratamientos. Se observó que la auxina que más influyó en la emisión de raíces (valor promedio 2.39) fue el ácido indolacético (AIA) en una concentración de 0.1 mg L^-1 (Figura 1). Por otra parte, se encontró que independientemente del tipo de regulador    auxínico aplicado,   la concentración 0.1 mg L^-1  resultó apropiada para dar raíces de la categoría medias (4-6 raíces mayores a un cm de longitud) (Figura 1). Concentraciones menores o mayores que ésta, afectaron la variable analizada, generando un menor número de raíces para concentraciones muy bajas (valor promedio 2.15) ó inhibiendo la rizogénesis en concentraciones mayores (valor promedio 2.00). Sujana y Naidu (2011), comunican que un incremento en las concentraciones de BAP (bencilaminopurina) y ANA reducen la frecuencia y el número de tallos en M. piperita, enfatizando que existe un umbral máximo permitido en las concentraciones de BAP, a fin de lograr una respuesta positiva. Muhammad, et al., (2007), logró excelentes sistemas radiculares para esta especie aplicando altas concentraciones de AIB, mientras que en M. viridis L., se reportan concentraciones de 0.5 a 1.5 mg L^-1 de AIA para inducir enraizamiento (Raja et al., 2008). En M. piperita, se logró un incremento en el peso del sistema radical y en crecimiento del tallo empleando AIB en concentraciones de 0.6 mg L^-1, atribuyendo también este efecto al pH del medio (Santoro et al., 2013). Los tratamientos con AIA a 0.01, 0.1 y 1 mg L^-1 presentaron entre un 42 a 50 % en las categorías raíces medias y un 17 a 25 % de raíces de la categoría abundantes (Figura 1). En M. piperita (Sujana et al., 2011), no obtuvieron desarrollo del sistema radical con la adición de AIA, pero lo obtuvieron con ANA en concentraciones superiores a 2.0 mg L^-1. En M. spicata, la adición de 4 mg L^-1 de ANA produjo el mayor desarrollo de raíces (Samantaray et al.,  2012). En M. piperita var Columna (Ionescu - Mălăncus et al., 2009), obtuvieron un máximo de raíces empleando 4.92 μM AIB. En el tratamiento testigo se registraron plántulas con escaso desarrollo radicular (valor promedio 1.39), un comportamiento similar fue observado en un medio libre de auxinas en M, piperita (Sujana et al., 2011).

Al cabo de dos semanas la tasa de multiplicación alcanzada fue de 1:8 (Figura 2a); correspondiéndose con resultados obtenidos en la provincia de Mendoza (Martínez et al., 1991); los cuales obtuvieron en 15 días de ensayo un promedio de un tallo con 5 nudos por explanto. En M. piperita, en un periodo de 40 días, Sunandakumari, et al., (2004), obtienen por segmento nodal 4 tallos con 5 nudos.

El 100 % de los explantos enraizados in vitro, lograron superar la etapa de aclimatación, estando dentro de los valores máximos obtenidos para otras especies aromáticas (Sunandakumari et al., 2004). La plasticidad de esta especie, permite conseguir altas tasas de supervivencia una vez finalizada la micropropagación, lo cual indica que esta técnica es factible de ser aplicada a nivel de producción masiva de plantas con excelente sanidad. En la Figura 2b, se presenta el estado de desarrollo de los plantines obtenidos in vitro antes de ser trasladados a los canteros de invernadero.

Disinfection protocol applied in the laboratory was effective for contaminants control, reaching 92 % asepsis. Recorded contamination appeared within four days, corresponding to 43 % of bacteria and 57 % fungus. This is a highly promissory aspect for our region, due that in other places as Mexico and Rumania the presence of endogenous contaminants limit application of this technique (Hector et al., 2005; Ionescu - Mălăncus et al., 2009). As consequence of the agents used, necrosing of explants was not observed neither liberation of phenols in the culture medium. The analysis of the node number (average value of 2.38) and number of branches (average value 1.63) did not show statistically significant differences among treatments. The number of branches is a characteristic that is kept independently from the applied treatment. In the auxin free treatment, an average of 2.0 nodes/branch was recorded, and with the adding of auxins to the culture medium, it increases up to 2.63 nodes/branch, which increases multiplication rate. In other species as Vitex negundo (Kannan et al., 1998), Syzygium travancoricum (Anand et al., 1999), Ancistrocladus abbreviates (Bringmann et al., 1999) and Coleus blumeni (Rani et al., 2006), the use of NAA improves the growth response of stems when nodal segments were used. In this work, nodal segments constitute an adequate source of explants with excellent response; similar observations have been recorded for medicinal species such as Rauwolfia serpentine (Roy et al., 1995), Emblica officinalis (Rahaman et al., 1999), Holarrhena antidysenterica (Ahmed et al., 2001) and Enicostemma hyssopifolium (Seetharam et al., 2002).

In the number of roots statistically significant differences were detected (F=2,54, gl=9 and p=0.01) among the treatments. It was observed that the auxin that influenced the most in the root emission (average value 2.39) was indole acetic acid (IAA) at a concentration of 0.1 mg L^-1 (Figure 1). On the other hand, independently from the type of auxin (regulator applied), concentration 0,1 mg L^-1 turned out to be appropriate to bear roots of the Medium category (4-6 roots larger than a cm length) (Figure 1). Smaller or larger concentrations than this affected the analyzed variable, generating a smaller number of roots for really low concentrations (average value 2.15) or inhibiting the rhizogenesis at higher concentrations (average value 2.00). Sujana and Naidu (2011), inform that an increment in the BAP (benzylaminopurine) and NAA reduce the frequency and the number of stems in M. piperita, emphasizing that there is a maximum allowed threshold in BAP concentrations so that a positive answer can be achieved. Muhammad, et al., (2007), accomplished excellent rooting systems for this species by applying high concentrations of IBA, while in M. viridis L., concentrations from 0.5 to 1.5 mg L^-1 to induce rooting are reported (Raja et al., 2008). In M. piperita, an increase in the weight of the radical system and in growth of the stem was reached by using IBA in concentrations of 0.6 mg L^-1, assigning this effect also to the pH of the mean (Santoro et al., 2013). The treatments with IAA at 0.01, 0.1 and 1 mg L^-1 presented between 42 and 50 % in the Medium roots category, and a 17 to 25 % in the Abundant roots category (Figure 1). In M. piperita (Sujana et al., 2011) there was no development of the radical system with addition of IAA, but  there was with NAA at concentrations higher than 2.0 mg L^-1. In M. spicata the addition of 4 mg L^-1 of NAA produced the higher development of roots (Samantaray et al., 2012). In M. piperita var Columna (Ionescu - Mălăncus et al., 2009) a maximum of roots was obtained by using 4.92 μM AIB. In the control treatment, seedlings with scarce rooting development were registered (average value 1.39), a similar behavior was observed in a mean auxin free in M. piperita (Sujana et al., 2011).

Within two weeks, the multiplication rate reached was 1:8 (Figure 2a); corresponding with results obtained in the province of Mendoza (Martinez et al., 1991), which obtained in 15 days of assay in average one stem with 5 nodes per explant. In M. piperita, in a period of 40 days, Sunandakumari, et al., (2004), obtained by nodal segment 4 stems with 5 nodes.

The total of explants rooted in vitro achieved to overcome acclimation phase, being within the maximum values obtained for other aromatic species (Sunandakumari et al., 2004). Plasticity of this species allows to obtain high survival rates once micropropagation has finished, which indicates that this technique is feasible of being applied at a massive production level with plants of excellent sanity. In Figure 2b, the state of development of the seedlings obtained in vitro before being taken to the greenhouse stonemasons is presented.

III. Ensayo de macropropagación por esquejes

III. Propagation test by cuttings

Todos los tratamientos aplicados para el enraizamiento de esquejes fueron exitosos, lográndose el 100 % de enraizamiento. Los sistemas radiculares en las plántulas, presentaron diferente aspecto en cantidad y calidad de raíces. El tratamiento ANA 50 mg L^-1 alcanzó un 50 % de raíces de la categoría de raíces medias, un 30 % de la categoría abundante, y 10 % en la categoría raíces escasas, Figura 3a. Se observaron raíces finas y pequeñas al disminuir la concentración de ANA. El tratamiento testigo presentó altos valores en raíces escasas, esta respuesta resalta la importancia de la aplicación de reguladores de crecimiento, para favorecer el proceso de enraizamiento de estacas.

Con ANA a 50 mg L^-1 se analizó el efecto de cuatro sustratos en el proceso de rizogénesis. Los porcentajes de enraizamiento alcanzaron el 100 % en todos los sustratos empleados. Sin embargo, se visualizaron desigualdades en la cantidad y aspecto de las raíces, Figura 3b.

Del análisis cualitativo realizado, el tratamiento perlita + arena + lombricompuesto, fue el sustrato que permitió el desarrollo de un sistema radicular abundante, seguido por la mezcla de perlita más arena, Figura 4.

Probablemente la diferencia cualitativa de los sistemas radicales observados, se debió al aporte de nutrientes por parte del lombricompuesto, el cual mejoró la nutrición de los nuevos tejidos generados. La acción de las lombrices en el sustrato incrementa la fracción nitrogenada del suelo (Eriksen-Hamel y Whalen, 2007), provee de macro y micronutrientes, mejora la disponibilidad de nutrientes e incrementa la actividad microbiana del suelo (Cacciamani, 2004).  La determinación de la biomasa confirmó lo observado en invernadero (Tabla 1).

Se debe reconocer la importancia de conformar un buen sustrato, que aporte las condiciones necesarias para el proceso de rizogénesis, esto es: elevada aireación (aportada por la perlita y arena), aporte de minerales (lombricompuesto) y facilitar el desarrollo radicular (arena) (Valenzuela et al.,2006).

La macropropagación por esquejes es un método práctico para la obtención de plantines, los cuales pueden ser cultivados al cabo de 30 días de iniciado el proceso, estos resultados guardan semejanza con los informados para M. arvensis, en donde a los 25 días las microestaquillas enraizadas se encuentran en condiciones para el transplante a campo (Chagas et al., 2008).

Se alcanzó con éxito la propagación de menta japonesa por ambas técnicas de propagación asexual (micro y macropropagación de esquejes). La aplicación de los reguladores de crecimiento auxínico empleados, estimuló el desarrollo radicular tanto en los explantos nodales, como en los esquejes.

All applied treatments for rooting of cuttings were successful, achieving 100 % of rooting. Rooting systems in the seedlings presented different aspect in quantity and quality of roots. Treatment NAA 50 mg L^-1 reached 50 % of roots from the Medium root category, 30 % from the abundant category and 10 % from the scarce category, Figure 3a. Fine and small roots were observed by diminishing NAA concentration. Witness treatment presented high values of scarce roots, this response highlights the importance of the application of regulators of growth to favor the rooting process of cuttings.

The effect of four substrates in the rhyzogenesis process was analyzed with NAA at 50 mg L^-1. The rooting percentages reached 100 % in all used substrates. However, disparities in quantity and aspect of the roots were observed, Figure 3b.

From the qualitative analysis made, the treatment perlite + sand + earthworm compost, it was the substrate that allowed the development of an abundant rooting system, followed by the mix of perlite plus sand, Figure 4.

It is probable that the qualitative difference of the radical systems observed was due to the delivery of nutrients from the earthworm compost, which improved nutrition of the new generated tissues. The earthworm action in the substrate increases the nitrogen fraction of the soil (Eriksen-Hamel and Whalen, 2007). It delivers macro and micronutrients, improves the availability of nutrients and increases the microbial activity of the soil (Cacciamiani, 2004). Determination of biomass confirmed what was observed in the greenhouse (Table 1).

The importance of conforming a good substrate that gives the necessary conditions for the rhyzogenesis process must be recognized, meaning: elevated aeration (given by perlite and sand), minerals delivery (earthworm compost) and facilitate the rooting development (sand) (Valenzuela et al., 2006).

Macropropagation by cuttings is a practical method for the obtaining of seedlings, which can be grown within 30 days once the process has begun; these results keep great similarity with the ones informed for M. arvensis, where in 25 days the rooted microcuttings are in condition for field transplant (Chagas et al., 2008).

Propagation of Japanese mint was achieved successfully by both techniques of asexual propagation (micro and macropropagation of cuttings). The application of the used auxin (growth regulators) stimulated the rooting development in both nodal explants and cuttings.

Substrate

Substrate Dry Weight (g)

Perlite

0.6285 a

Perlite + sand

0.6470 b

Perlite + earthworm compost

0.6395 a

Perlite + sand +  earthworm  compost

0.6715 c