REVISTA BIO CIENCIAS

PALABRAS CLAVE

KEY WORDS

In vitro, Pinguicula, Lentibulariaceae, ornamental, insectívoras

In vitro, Pinguicula, Lentibulariaceae, ornamental, insectivorous

RESUMEN

ABSTRACT

Se colectaron semillas de violeta de barranca (Pinguicula moranensis H.B. Kunth, var. Neovolcánica Zamudio) en el Parque Nacional “El Chico” en el Estado de Hidalgo, México, con el objetivo de desarrollar una estrategia de propagación masiva in vitro mediante la regeneración de brotes a partir de callos. Se germinaron las semillas en el medio ¼ MS, con 100 mg L^-1 de inositol, 0.4 mg L^-1de tiamina, 20 g L^-1 de sacarosa, 8.5 g L^-1 de agar y pH 5.7, (medio basal con orgánicos, MBO), sin reguladores de crecimiento, donde presentaron baja germinación (5 %). De estas se seleccionaron plántulas de 10 días, se incubaron en medio MBO, con BA (0, 0.5 mg L^-1) en combinación con ANA (0, 0.5 mg L^-1), o 2,4 D (0, 1.0 mg L^-1). La presencia de 2,4-D (1.0 mg L^-1), produjo necrosis en esta especie en todos los casos; sin embargo, el medio MBO, con BA 0.5 mg L^-1, ANA 0.5 mg L^-1, permitió la inducción de 100 % de callo, que se observó definido y friable. El callo obtenido se incubó en medio MBO, con BA (0, 1 y 2 mg L^-1) y ANA (0, 0.1, 0.5 mg L^-1). Se observó la mejor inducción de brotes a partir de callos, en el tratamiento MBO, adicionado con BA (1 mg L^-1) y ANA (0.5 mg L^-1)., encontrando un promedio de 1,957+125 brotes por frasco. Los brotes formados se obtuvieron con una gran proporción de vitrificación, por lo que se incubaron en el mismo medio pero sin reguladores, donde se desvitrificaron e individualizaron y formaron raíz espontáneamente. Lo que permite definir de esta forma un eficiente protocolo de propagación masiva para esta especie.

Seeds of Pinguicula moranensis were collected in the “El Chico” National Park in the state of Hidalgo, Mexico, in order to develop a propagation strategy for in vitro mass multiplication. Seeds were germinated in medium ¼ MS supplemented with 100 mg L^-1 inositol, 0.4 mg L^-1 thiamine, 20 g L^-1 sucrose, 8.5 g L^-1 of agar, pH 5.7 (Basal medium with organics, MBO), without growth regulators showing low germination (5 %). Seedlings of 10 days, were incubated in medium MBO with BA (0, 0.5 mg L^-1) in combination with NAA (0, 0.5 mg L^-1), or 2,4D (0, 1.0 mg L^-1). The presence of 2,4-D (1.0 mg L^-1), caused necrosis in this species, however MBO medium, supplemented with BA 0.5 mg L^-1 and NAA 0.5 mg L^-1 , allowed 100 % induction of callus which observed defined and friable. The callus obtained was incubated in the above medium MBO with BA (0, 1 and 2 mg L^-1) and NAA (0, 0.1, 0.5 mg L^-1). The best response was observed with medium MBO supplemented with BA (1mg L^-1) and NAA (0.5 mg L^-1), finding an average of 1,957 + 125 shoots per jar. The formed shoots were obtained with a large proportion of vitrification, so they were incubated in the same medium but without growth regulators, where they were devitrified and individualized, rooting spontaneously. Allowing thereby the definition of an efficient protocol for mass propagation of the species.

Introducción

Introduction

Existen más de 23,000 especies, solo de plantas vasculares en la flora de México (Villaseñor, 2004), donde al menos 20 % presenta un potencial ornamental, que se determina por motivos religiosos, culturales o económicos (Espinosa et al., 2009). Particularmente el género Pinguicula  posee un elevado potencial ornamental, dadas sus características morfológicas, como son sus hojas gruesas y carnosas, con pelos glandulares y mucílago, que tienen el papel de atraer, inmovilizar y digerir pequeños insectos, además de presentar flores de diversos colores que le confieren un notable valor decorativo (Clapa et al., 2010; Zamudio, 2005). En México existen más de 40 especies de Pinguicula y 38 son endémicas, por lo que se recomienda se incluyan en programas de reproducción para optimizar su manejo y evitar que estos ejemplares sean objeto de prácticas indebidas como la colecta y el tráfico ilegal (Espinosa et al., 2009).

Algunas especies de pinguicolas se propagan mediante semillas o explantes de hoja de roseta de invierno que regeneran brotes en su parte basal, sin embargo esta propagación se limita en número a dicho material (Gutiérrez, 2005), por lo que la propagación in vitro de estas especies puede ser una metodología útil para su multiplicación. Se ha estudiado la respuesta a la propagación in vitro de algunas especies del género Pinguicula (Adams et al., 1979; Clapa et al., 2010) y se ha evaluado la proliferación de brotes con medios que utilizan bajas concentraciones de nutrientes en diversas especies de plantas insectívoras (Adams et al., 1979; Goncalves et al., 2008; Clapa et al., 2010); así como la aplicación de reguladores de crecimiento (Saetiew et al., 2011; Goncalves et al., 2008), con formación directa de brotes en hojas completas de P. lusitanica L. y P. vulgaris L. ante la aplicación de 0.5 mg L^-1 de 6-bencil adenina (BA) o cinetina (KIN) (Goncalves et al., 2008; Clapa et al., 2010). Por otro lado, P. moranensis H.B. Kunth, formó brotes a partir de explantes de hoja madura completa, en medio Linsmaier y Skoog (1965), a 1/5 de su concentración, adicionado con 0.02 mg L^-1 de BA y 0.1 mg L^-1 de  ácido 2-naftalen acético (ANA), con la presencia de algunos microorganismos endógenos que dificultaron el establecimiento del cultivo (Adams et al., 1979). Sin embargo, Becerra et al., (2004) registra una mejor respuesta morfogenética incluso en callo y menciona la disminución de la capacidad morfogenética en relación a la edad del explante. La bibliografía existente para este género reporta la inducción de brotes de forma directa sobre explantes de hoja madura, sin embargo, no se ha reportado la regeneración de brotes o embriones a partir de callos inducidos. De acuerdo a lo anterior, el objetivo de este trabajo fue obtener un protocolo para multiplicación in vitro de P. moranensis H.B. Kunth, var. Neovolcánica Z. a través de la regeneración de brotes en callos inducidos a partir de plántulas pequeñas obtenidas de semillas.

There are over 23,000 species, only vascular plants, in Mexico’s flora (Villaseñor, 2004), where at least 20 % present ornamental potential, which is determined by religious, cultural or economic reasons (Espinosa et al., 2009). Particularly, the genre Pinguicula has a high ornamental potential given its morphologic characteristics such as its thick fleshy leaves, with glandular hair and mucilage, which have the power to attract, immobilize and digest small insects, besides presenting flowers of different colors that grant a noticeable decorative value (Clapa et al., 2010; Zamudio, 2005). In Mexico, there are over 40 species of Pinguicula and 38 of them are endemic, so it is recommended to include them in reproduction programs to optimize their management and avoid their illegal use as traffic or collection (Espinosa et al., 2009).

Some species of pinguicolas propagate by seeds or explants from leaf of winter rosette which regenerate shoots in their basal part; however, this propagation is limited in number to such material (Gutiérrez, 2005), so in vitro propagation of this species can be a useful methodology for its multiplication. Response to in vitro propagation of some species of the genre Pinguicula (Adams et al., 1979; Clapa et al., 2010) has been studied and the proliferation of shoots with mediums that use low concentrations of nutrients in diverse species of insectivore plants has been evaluated (Adams et al., 1979; Goncalves et al., 2008; Clapa et al., 2010); and also the application of regulators of growth (Saetiew et al., 2011; Goncalves et al., 2008), with direct formation of shoots in complete leaves of P. lusitanica L. and P. vulgaris L. before the application of 0.5 mg L^-1 of 6-bencil adenine (BA) o kinetin (KIN) (Goncalves et al., 2008; Clapa et al., 2010). On the other hand, P. moranensis H.B. Kunth formed shoots from explants of complete mature leaves in medium Linsmaier and Skoog (1965), at 1/5 of their concentration, added with 0.02 mg L^-1 of BA and 0.1 mg L^-1 of 2-naftalen acetic acid (NAA), with the presence of some endogenous microorganisms that hindered the establishment of the culture (Adams et al., 1979). However, Becerra et al., (2004) recorded a better morphogenetic response even in callus and mentions the decrease of the morphogenetic capacity in relation to the age of the explant. The existent bibliography for this genre reports the induction of shoots in direct form on explants of mature leaves; however, the regeneration of shoots or embryos from the induced calluss has not been reported. As indicated by the foregoing, the aim of this work was to obtain a protocol for the multiplication in vitro of P. moranensis H.B. Kunth, var. Neovolcanic Z. through the regeneration of shoots in callus induced from small seedlings obtained from seeds.

Materiales y Métodos

Material and Methods

El trabajo se realizó en el laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Unidad de Morfología y Función en la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM, México.  Se utilizaron semillas de P. moranensis H.B. Kunth., var neovolcánica Z. que fueron colectadas  en el mes de junio del 2015, en la presa “El Cedral”  dentro del Parque Nacional “El Chico”, Hidalgo, México, una semana después, éstas se lavaron con agua y detergente comercial, se enjuagaron con agua destilada dos veces y se desinfestaron en alcohol al 70 % durante 2 minutos. Después se sumergieron en una solución de hipoclorito de sodio al 20 % (a partir de cloro comercial al 6 %), con 150 µL L^-1 de Tween-20, durante 5 minutos y se enjuagaron tres veces con agua destilada estéril en cámara de flujo laminar.

The work was performed in the laboratory of Culture of Vegetative Tissues from the Unit of Function and Morphology in the Facultad de Estudios Superiores Iztacala, UNAM, Mexico. Seeds of P. Moranensis H.B. Kunth.,var Neovolcanic Z. collected in June 2015 in the dam “El Cedral” within the National Park “El Chico”, Hidalgo, Mex. were used; after a week, they were washed with water and commercial detergent, rinsed with distilled water twice and disinfected in alcohol  at 70 % during 2 minutes. After, they were submerged in a solution of sodium hypochlorite at 20 % (from commercial chlorine at 6 %), with 150 µL L^-1 of Tween-20, during 5 minutes and rinsed three times with distilled sterile water in laminar flux chamber.

Condiciones de cultivo

Culture conditions

Para su germinación, las semillas se sembraron en medio Murashigue y Skoog (1962), a un cuarto de su concentración  ¼ MS , con 100 mg L^-1 de inositol, 0.4 mg L^-1 de tiamina, con 20 g L^-1 de sacarosa, 8.5 g L^-1 de agar y pH 5.7,  sin reguladores de crecimiento (medio MBO).

Para inducir la formación de callo, se utilizaron plántulas de 10 días de emergidas, colocándose en frascos de vidrio de 120 mL con 20 mL de medio MBO,  adicionado con  BA  y  ANA ó  Ácido 2,4 Diclorofenoxiacético (2,4-D), con 20 g L^-1 de sacarosa, 8.5 g L^-1 de agar y pH 5.7, con seis repeticiones por tratamiento (Tabla 1), en un diseño factorial completamente al azar.

Una vez inducida la formación del callo, se tomó 1 cm³ del mismo, como explante para inducir la formación de brotes, incubando el tejido en 20 mL de medio MBO, con BA  0, 1.0, 2.0 mg L^-1 y ANA 0, 0.1 y 0.5 mg L^-1, con 6 repeticiones por tratamiento (Tabla 2), utilizando un diseño factorial completamente al azar.

Los medios utilizados en este estudio se esterilizaron en autoclave a 121 °C y 1.05 kg cm^-2. Todos los tratamientos se colocaron en una cámara de crecimiento con 22-26 °C, fotoperíodo de 16/8 horas (luz/obscuridad), con una radiación fotosintéticamente activa de 100 µmol m^-2 s^-1, a partir de tubos fluorescentes blanco frío.

For their germination, seeds were sowed in medium Murashigue and Skoog (1962) at a quarter of its concentration ¼ MS, with 100 mg L^-1 inositol, 0.4 mg L^-1 thiamine, with 20 g L^-1 sucrose, 8.5 g L^-1 agar and pH 5.7, with no growth regulators (MBO medium).

To induce callus formation, seedling of 10 days of emergence were used, placing them in glass jars of 120 mL with 20 mL of MBO, added with BA and NAA or 2,4 dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), with 20 g L^-1 sucrose, 8.5 g L^-1 agar and pH 5.7, with six repetitions per treatment (Table 1), using a factorial design completely randomized. 
Once the formation of the callus was induced, 1 cm³ was taken as explant to induce the formation of shoots, incubating tissue in 20 mL of medium MBO with BA 0,1.0, 2.0 mg L^-1 and NAA 0, 0.1 and 0.5 mg L^-1, with 6 repetitions per treatment (Table 2), using a factorial design completely randomized.

The mediums used in this study were sterilized by autoclave at 121 °C and 1.05 kg cm^-2. All treatments were placed in a growth chamber with 22-26 °C, photoperiod of 16/8 hours (light/darkness), with a photosynthetically active radiation of 100 µmol m^-2 s^-1 from fluorescent white cold tubes.

Análisis estadístico

Statistical analysis

Los datos de brotes observados, se sometieron a análisis de varianza (ANOVA) , para evaluar diferencias entre tratamientos utilizando el paquete Sigma Plot for Windows V.11 (Systat Software, Inc.). Las diferencias significativas entre medias se determinaron usando una prueba de Tukey (p=0.05). Los datos se presentan como media ± desviación estándar.

Data from the observed shoots were submitted to a variance analysis (ANOVA) to evaluate the differences between treatments using the package Sigma Plot for Windows V.11 (Systat Software, Inc.). Significant differences between averages were determined by using a Tukey test (p=0.05). Data are presented as average ± standard deviation.

Resultados y Discusión

Results and Discussion

Se observó un bajo porcentaje (5 %), de germinación in vitro de las semillas de P. moranensis, tal como lo reportan Grevenstuk y Romano (2012), para P. vulgaris. Sin embargo, esta germinación podría ser mayor con un tratamiento de estratificación con frío como lo recomienda Heslop-Harrison (2004), para este género, aun cuando parece no haber diferencias de acuerdo al mismo autor. 

Las pequeñas plántulas usadas como explantes para la inducción de callo, presentaron obscurecimiento y necrosis de tejidos en todos los tratamientos con Ácido 2,4-D, por lo que se puede asegurar que la presencia de esta auxina es fuertemente limitante en la viabilidad en P. moranensis,  sin embargo la aplicación de ANA en combinación con BA, permitió la inducción total de callos a partir de este tipo de explante, el callo producido se observó definido y friable solo en el medio MBO, adicionado con BA 0.5 mg L^-1 y ANA 0.5 mg L^-1  (Tabla 3).

En los tratamientos para inducir brotes, como resultado de la incubación de 1 cm³ de callo (Tabla 4), se observó la inducción de algunos brotes por frasco (230+35 y 278+54) con la presencia de BA (1 y 2 mg L^-1). El número de brotes se incrementó al estar presentes ambas hormonas, 1 y 2 mg L^-1 de BA y 0.1 mg L^-1 de ANA (1,128+192 y 1,393+283 respectivamente).

Los mejores resultados en la inducción de brotes se encontraron en los tratamientos con 1 y 2 mg L^-1de BA y 0.5 mg L^-1 de ANA respectivamente, donde se encontraron 1,957+125 y 1,530+211 brotes por frasco, sin embargo la presencia de BA en el medio indujo la formación de brotes vitrificados en un porcentaje mayor de un 80 % en el medio con 1 mg L^-1 de BA y 0.5 mg L^-1 de ANA (Figura 1B), este estado de vitrificación se conoce como hiperhidratación y es una malformación, anatómica y fisiológica, que hace que el tejido se sobrehidrate (Paques y Boxus, 1987), donde las nuevas plantas presentan además hipertrofia, con deficiencia de clorofila a y b, pérdida de la lignificación en la pared celular y hojas con grandes espacios intercelulares en mesófilo, el tejido se ha correlacionado con la disponibilidad de agua, microelementos y desbalance hormonal en el medio de cultivo (Kataeva et al., 1991). Se ha reportado que el tejido vitrificado se puede retornar a la normalidad mediante aereación del cultivo y cambio a medios sin hormonas (Chien-Chou et al., 2005), por lo que los brotes de P. moranensis vitrificados se transfirieron al mismo medio pero sin hormonas.

De forma semejante a lo encontrado por Grevenstuk y Romano (2012), y Clapa et al., (2010), en P. vulgaris, quienes reportan enraizamiento espontaneo en un medio sin reguladores. Este medio permitió no solo desvitrificar los brotes e independizarlos, también observamos formación espontánea de raíces en más del 70 % de brotes después de 30 días de incubación, lo que puede deberse a la presencia de altos niveles de auxinas endógenas como se ha encontrado para otras especies (Malá et al., 2005).

Después de 60 días de crecimiento en medio MBO, las plantas presentaron un tamaño entre 4 y 5 cm (Figura 2), se trasladaron a contenedores de 200 ml con 100 mL de peat moss – agrolita (1:1) y con 30 días de aclimatización se observó floración (Figura 3).

A low percentage (5 %) of germination in vitro of seeds of P. moranensis was observed, as reported by Grevenstuk and Romano (2012) for  P. vulgaris. Nevertheless, this germination might be higher with a stratification treatment in cold, as recommended by Heslop-Harrison (2004) for this genre, even when it seems there are no differences according to the same author.

Small seedlings used as explants for the callus induction presented darkness and tissue necrosis in all treatments with 2,4-D acid, so it can be assured that the presence of this auxin is strongly limiting in the viability of P. moranensis; however, the application of NAA in combination with BA allowed the total induction of callus from this type of explant, the callus produced was observed defined and friable only in the MBO medium, added with BA 0.5 mg L^-1 and NAA 0.5 mg L-1  (Table 3).   

In treatments to induce shoots, as result of the incubation of 1 cm³ of callus (Table 4), the induction of some shoots per jar (230+35 and 278+54) was observed with the presence of BA (1 and 2 mg L^-1). The number of shoots was increased by the presence of both hormones, 1 and 2 mg L^-1 BA and 0.1 mg L^-1 NAA (1,128+192 and 1,393+283, respectively).

The best results in induction of shoots were found in treatments with 1 and 2 mg L^-1 BA and 0.5 mg L^-1 NAA respectively, where 1,957+125 and 1,530+211 shoots per jar were found; nevertheless, the presence of BA in the medium induced the formation of vitrified shoots in a percentage higher than 80 % in the medium with 1 mg L^-1 BA and 0.5 mg L^-1 NAA (Figure 1B);  this state of vitrification is known as hyperhydration and it is a malformation, anatomic and physiologic, that makes the tissue to be overhydrated (Paques and Boxus, 1987), where the new plants present hypertrophy, with deficiency of chlorophyll a and b, loss of lignification in the cellular wall and leaves with big intercellular spaces in mesophyll, the tissue has been correlated with the availability of water, microelements and hormonal unbalance in the culture medium (Kataeva et al., 1991). It has been reported that the verified tissue can return to normality by aeration of the culture and change to mediums with no hormones (Chien-Chou et al., 2005), therefore vitrified shoots of P. moranensis were transferred at the same time with no hormones.

Similarly to what Grevenstuk and Romano (2012), and Clapa et al., (2010) found in P. vulgaris, reporting a spontaneous rooting in a medium with no regulators. This medium allowed not only the devitrification and freed of shoots, but we also observed the spontaneous formation of roots in more than 70 % of shoots after 30 days of incubation, which can be due to the presence of high levels of endogen auxins as it has been found in other species (Malá et al., 2005).

Similarly, after 60 days of growth in medium MBO, plants presented a size between 4 and 5 cm (Figure 2), they were moved to containers of 200 ml with 100 ml of peat moss – agrolite (1:1) and with 30 days of acclimation flowering was observed (Figure 3).

Conclusiones

Conclusions

Bajo condiciones de fotoperiodo largo y medio MBO, germinaron solo un 5 % de semillas de P. moranensis.  Las plántulas pequeñas, obtenidas a partir de las semillas de Pinguicula moranensis, usadas como explantes, permitieron obtener una rápida inducción de callos in vitro, utilizando el medio MBO, con BA 0.5 mg L^-1 y ANA 0.5 mg L^-1. Posteriormente el callo obtenido, presentó la mejor inducción de brotes después de 30 días de incubación en medio MBO, adicionado con  BA 1.0 mg L^-1 + ANA 0.5 mg L^-1. Los brotes obtenidos, se encontraron vitrificados y retornaron a un estado normal al colocarlos por 30 días en medio sin reguladores de crecimiento, logrando también el enraizamiento espontáneo. El procedimiento descrito aquí permite definir un protocolo eficiente de propagación masiva de Pinguicula moranensis.

Under conditions of long photoperiod and MBO medium, only 5 % of the seeds of P. moranensis germinated. Small seedlings, obtained from seeds of Pinguicula moranensis, used as explants, allowed the obtaining of a rapid induction of callus in vitro, using the medium MBO, with BA 0.5 mg L^-1 and NAA 0.5 mg L^-1. Obtained shoots were found vitrified and returned to a normal state when placing them for 30 days in medium with no regulators of growth, achieving a spontaneous rooting. The procedure hereby described allows to define an efficient protocol of massive propagation of Pinguicula moranensis.