REVISTA BIO CIENCIAS

PALABRAS CLAVE

KEY WORDS

Estrés oxidativo, CYP 2E1, GSTT, halometanos

Oxidative stress, CYP 2E1, GSTT, halomethanes

RESUMEN

ABSTRACT

It has been shown that the isoform 2E1 of CYP 450 (CYP 2E1) and theta isoform of glutathione S-transferase (GSTT) are involved in the biotransformation of halomethanes (HMs) in mammals, which are disinfection by-products of water. In this study, a set of biomarkers related to exposure to these toxicants in the kidney of Goodea gracilis (a Mexican endemic fish) treated with CH₂Cl₂ (0.006, 0.03, 0.06, 0.06 and 6 mg L^-1), CHCl3 (0.01, 0.1, 1, 10 and 100 mg L^-1) and BrCHCl2 (0.002, 0.01, 0.1, 1, 10 mg L^-1) were evaluated. Only activity of CYP 2E1 induced by BrCHCl₂ and CH₂Cl₂ was higher than controls. GSTT metabolism and pro-oxidant forces (O₂, H₂O₂ and CH₂O) were irregular regarding treatments and controls. Damage to cell membranes (ROOH and SRATB) showed a similar trend among the HMs. Protein oxidation was lower than controls except the one caused by the CHCl₃. The CH₂Cl₂ stimulated the enzymes involved in the antioxidant defense (superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase), as also occurred with total glutathione S-transferase, while the others HM elicited an irregular response. These findings suggest that toxic effects elicited by HM on the kidney of fish are complex and more studies are needed to expand knowledge on the subject.

It has been shown that the isoform 2E1 of CYP 450 (CYP 2E1) and theta isoform of glutathione S-transferase (GSTT) are involved in the biotransformation of halomethanes (HMs) in mammals, which are disinfection by-products of water. In this study, a set of biomarkers related to exposure to these toxicants in the kidney of Goodea gracilis (a Mexican endemic fish) treated with CH₂Cl₂ (0.006, 0.03, 0.06, 0.06 and 6 mg L^-1), CHCl₃ (0.01, 0.1, 1, 10 and 100 mg L^-1) and BrCHCl2 (0.002, 0.01, 0.1, 1, 10 mg L^-1) were evaluated. Only activity of CYP 2E1 induced by BrCHCl₂ and CH₂Cl₂ was higher than controls. GSTT metabolism and pro-oxidant forces (O₂, H₂O₂ and CH₂O) were irregular regarding treatments and controls. Damage to cell membranes (ROOH and SRATB) showed a similar trend among the HMs. Protein oxidation was lower than controls except the one caused by the CHCl₃. The CH₂Cl₂ stimulated the enzymes involved in the antioxidant defense (superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase), as also occurred with total glutathione S-transferase, while the others HM elicited an irregular response. These findings suggest that toxic effects elicited by HM on the kidney of fish are complex and more studies are needed to expand knowledge on the subject.

Introducción

Introduction

En condiciones óptimas muchos tóxicos pueden formarse en los cuerpos de agua como es el caso de los halometanos (HM) (Senem-Uyguner et al., 2004). Estos compuestos son altamente liposolubles, presentan elevada electronegatividad y bajo punto de ebullición, así como alta presión de vapor (ATSDR, 2016). La isoforma 2E1 del citocromo P450 (CYP 2E1) es capaz de biotransformar a los HM en mamíferos y peces (Melnick et al., 1998; Dzul-Caamal et al., 2013), así como la isoforma theta de la glutatión S-transferasa (GSTT) (Dekant y Vamvakas, 1993; Vega-López et al., 2012; Dzul-Caamal et al., 2013; Uraga-Tovar et al., 2014). En mamíferos se ha demostrado que la biotransformación de los HM puede generar metabolitos altamente reactivos y oxidantes como el formaldehido, nitrosaminas y fosgeno, entre otros (Dekant y Vamvakas, 1993; Melnick et al., 1998; Dzul-Caamal et al., 2013). No obstante, los organismos tienen diferentes mecanismos para contrarrestar este daño. En un estado metabólico en equilibrio, la actividad de las defensas antioxidantes como la superóxido dismutasa (SOD), catalasa (CAT) y la glutatión peróxidasa (GPx) reducen la capacidad oxidante de las especies reactivas del oxígeno, ROS por sus siglas en ingles “Reactive Oxygen Species”, pero en estados patológicos pueden oxidar diferentes biomoléculas (Hermes-Lima, 2004).

Para las autoridades mexicanas las especies vulnerables y en peligro de extinción son prioritarias para su estudio (Olivares-Rubio et al., 2013). El tiro oscuro Goodea gracilis (Hubbs y Turner, 1939) es una especie vulnerable (IUCN Red List Status Ref. 84930) y típica de la ictiofauna del centro de México. Es una especie dulceacuícola, demersal y de climas templados, con preferencia por aguas alcalinas o neutras, cuya alimentación ocurre por filtración (Dzul-Caamal et al., 2013). Su fertilización es interna, presentan viviparidad y matrotrofia (Doadrio y Domı́nguez, 2004). En algunos casos habita ambientes alimentados por plantas de tratamiento de aguas residuales que contienen materia orgánica y precursores de HM (Vega-López et al., 2012; Olivares-Rubio et al., 2013). En el hígado y el riñón de G. gracilis “habitante de tres lagos del centro de México” se encontró que la presencia de HM fue capaz de inhibir la respuesta metabólica de estos peces (Olivares-Rubio et al., 2013), lo que sugiere la generación de metabolitos reactivos (Parkinson y Ogilvie, 2008) particularmente los derivados de la GST isoforma tetha. En adición, en el hígado de Chirostoma riojai “habitante de la Laguna de Zumpango ubicada en el Estado de México”; se presentó acoplamiento del CYP 2E1 y de la GSTT y estuvieron relacionados con las concentraciones ambientales de HM (Vega-López et al., 2012). El estudio de la respuesta renal en los peces, tanto en condiciones basales como en especímenes silvestres, es fundamental ya que en el pronefros (cabeza del riñón) ocurre la selección negativa y positiva de las células progenitoras hematopoyéticas (Janeway y Medzhitov, 2002; Davidson y Zon, 2004) además de los procesos de filtración renal en el mesonefros y metanefros (cuerpo del riñón) (Schnellmann, 2008). El objetivo de este estudio fue conocer la respuesta pro-oxidante y antioxidante de tres diferentes HM: diclorometano (CH₂Cl₂), triclorometano (CHCl₃) y bromodiclorometano (BrCHCl₂) en el riñón del Goodea gracilis a las concentraciones propuestas en el reporte previo de Dzul-Caamal et al., (2013), basadas en el límite máximo permitido en el agua potable de cada HM, que fue seleccionado como punto central de los tratamientos. Se midió la actividad de las enzimas responsables de la biotransformación de HM, fuerzas pro-oxidantes, daño oxidativo, así como la actividad de las enzimas involucradas en la defensa antioxidante y la conjugación con glutatión.

In optimum conditions, many toxics can be formed in water bodies, as the case of halomethanes (HM) (Senem-Uyguner et al., 2004). These compounds are highly fat-soluble, present elevated electronegativity and low boiling point, as well as high steam pressure (ATSDR, 2016). The isoform 2E1 of cytochrome P450 (CYP 2E1) is able to biotransform HM in mamals and fishes (Melnick et al., 1998; Dzul-Caamal et al., 2013), and the isoform theta from the glutathione S-transferase (GSTT) (Dekant and Vamvakas, 1993; Vega-López et al., 2012; Dzul-Caamal et al., 2013; Uraga-Tovar et al., 2014). In mammals, it has been shown that biotransformation of HM can generate highly reactive and oxidant metabolites, as formaldehyde, nitrosamines and phosgene, among others (Dekant and Vamvakas, 1993; Melnick et al., 1998; Dzul-Caamal et al., 2013). Nevertheless, organisms can have different mechanisms to counteract such damage. In a balanced metabolic state, the activity of the antioxidant defenses such as superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and the glutathione peroxidase (GPx) reduce the oxidant capability of reactive species of oxygen (ROS), but in pathological states, they can oxide different biomolecules (Hermes-Lima, 2004).

For Mexican authorities, vulnerable and endangered species are priority for their study (Olivares-Rubio et al., 2013). Goodea gracilis (Hubbs and Turner, 1939) is a vulnerable species (IUCN Red List Status Ref. 84930) and typical of the icthyofauna of central Mexico. It is a freshwater, demersal and mild climate species, with preference for alkaline or neutral waters, whose feeding occurs by filtration (Dzul-Caamal et al., 2013). Its fertilization is internal, they present viviparity and matrotrophy (Doadrio and Domı́nguez, 2004). In some cases, it inhabits environments fed by treatment plants of residual waters that contain organic matter and precursors of HM (Vega-Lopez et al., 2012; Olivares-Rubio et al., 2013). In liver and kidney of G. gracilis, inhabitant of three lakes from central Mexico, it was found that the presence of HM was able to inhibit the metabolic response of these fishes (Olivares-Rubio et al., 2013), which suggests the generation of reactive metabolites (Parkinson and Ogilvie, 2008), particularly those derived from the GST tetha isophorm. In addition, in the liver of Chirostoma riojai, inhabitant of the Zumpango Lagoon, located in the Estado de Mexico, Mexico; coupling of CYP 2E1 and GSTT was present, and they were related with the environmental concentrations of HM (Vega-López et al., 2012). The study of renal response in fishes, both in basal conditions and wild specimens, is fundamental since the negative and positive selection of hematopoietic progenitor cells occurs in the pronephros (kidney head) (Janeway and Medzhitov, 2002; Davidson and Zon, 2004), in addition to the renal filtration processes in the mesonephros and metanephros (kidney body) (Schnellmann, 2008). The objective of this study was to evaluate the pro-oxidant and antioxidant response of three different HM: dichloromethane (CH₂Cl₂), trichloromethane (CHCl₃) and bromodichloromethane (BrCHCl₂) in the kidney of Goodea gracilis to proposed concentrations in the previous report by Dzul-Caamal et al., (2013), based on the maximum allowed limit in potable water of each HMs, which was selected as central point of treatments. The activity of the responsible enzymes of the biotransformation of HM, pro-oxidant forces, oxidative damage, and the activity of involved enzymes in the antioxidant defense and the conjugation with glutathione was measured.

Materiales y Metódos

Materials and Methods

Especie bajo estudio y procedimiento experimental

Species under study and experimental procedure

Los progenitores fueron recibidos de donación y se mantuvieron en el laboratorio para su reproducción bajo las condiciones descritas por Dzul-Caamal et al., (2013). Para las pruebas se usaron juveniles de sexo indistinto de ocho meses (50.40±0.65 mm y 0.94±0.06 g) en estado no reproductivo nacidos en el laboratorio.

Se realizó una exposición a 96 h (6 especímenes por tratamiento) a diferentes concentraciones de HM [CH₂Cl₂ (grado HPLC, ≥99.8 %, Sigma-Aldrich) a 0.006, 0.03, 0.06, 0.6, 6 mg L^-1, CHCl₃ (grado HPLC, ≥99 %, Sigma-Aldrich) a 0.01, 0.1, 1, 10, 100 mg L^-1  y BrCHCl₂ (grado HPLC, ≥97 %, Sigma-Aldrich) a 0.002, 0.01, 0.1, 1, 10 mg L^-1]. Las diluciones de HM se prepararon en etanol absoluto. En todos los casos, la concentración de etanol en el control de disolvente fue 0.001 % en agua sintética semidura. Los ensayos fueron realizados por triplicado en garrafones de vidrio de 20 L a 24±1 °C con un volumen de 10 L de acuerdo con Dzul-Caamal et al., (2013). Dado que estos tóxicos son volátiles cada 24 h se renovó el tratamiento y se retiró la aireación durante 1 h posterior a la aplicación. La aireación fue constante y se suministró mediante bombas de aire de la Marca Elite modelo 800.

The progenitors were received from donation and were kept in the lab for their reproduction under conditions described by Dzul-Caamal et al., (2013). Juveniles of indistinct sex aged eight months (50.40±0.65 mm and 0.94±0.06 g) in non-reproductive state born in the lab were used for the tests.

A 96 h exposure (6 specimens per treatment) was made at different concentrations of HM [CH₂Cl₂ (grade HPLC, ≥99.8 %, Sigma-Aldrich) at 0.006, 0.03, 0.06, 0.6, 6 mg L^-1, CHCl₃ (grade HPLC, ≥99 %, Sigma-Aldrich) at 0.01, 0.1, 1, 10, 100 mg L^-1  and BrCHCl₂ (grade HPLC, ≥97 %, Sigma-Aldrich) at 0.002, 0.01, 0.1, 1, 10 mg L^-1]. Dilutions of HM were prepared in absolute ethanol. In all cases, the concentration of ethanol in dissolvent control was 0.001 % in synthetic semi-hard water. Assays were made by triplicate in glass bottle of 20 L at 24±1 °C with a volume of 10 L, according to Dzul-Caamal et al., (2013). Given that these are volatile toxics, treatment was renewed every 24 h and aeration was retired during 1 h after the application. Aeration was constant and supplied by air bombs branch Elite, model 800.

Biomarcadores

Biomarkers

La necropsia se realizó inmediatamente para obtener el riñón que fue pesado con una precisión de 0.1 mg y homogenizado a 1:5 (p/v) con solución buffer de fosfato usando micropistilos de teflón. Una porción fue centrifugada a 9,000 X g y a 4 °C por 15 minutos para obtener la fracción S9. Las fracciones no centrifugadas y S9 fueron almacenadas a -80 °C hasta el ensayo de biomarcadores (menos de dos semanas) con excepción de la cuantificación de ROS cuyo análisis fue inmediato. La fracción S9 se usó para medir las fuerzas pro-oxidantes así como para realizar los ensayos enzimáticos mientras que la fracción no centrifugada para la medición de biomarcadores de daño oxidativo. Los resultados se expresaron de acuerdo con la naturaleza de cada biomarcador; sin embargo, todos los casos se normalizaron por g de pez como en Dzul-Caamal et al., (2013).

Necropsy was made immediately to obtain the kidney, which was weighed with a 0.1 mg precision and homogenized at 1:5 (w/v) with buffer solution of phosphate using Teflon micropestles. A portion was centrifuged at 9,000 X g and at 4 °C during 15 minutes to obtain fraction S9. Non-centrifuged fractions and S9 were stored at -80 °C until the assay of biomarkers (less than two weeks), with exception of ROS quantification, such analysis was immediate. The fraction S9 was used to measure the pro-oxidant forces and to perform enzymatic assays, while the non-centrifuged fraction for the measurement of oxidative damage biomarkers. Results were expressed according to the sort of each biomarker; nevertheless, in all cases, they were normalized per g of fish as in Dzul-Caamal et al., (2013).

Biotransformación de HM

Biotransformation of HM

La actividad del CYP 2E1 (EC 1.14.14.1) se evaluó de acuerdo con el método de Cannady et al., (2003). Se tomó una alícuota de 100 µL de fracción S9 y se agregaron 400 µL de buffer de fosfatos (100 mM pH 6.8), se adicionaron 10 µL de NADPH (50 mM) y 10 µL de p-nitrofenol a 50 mM. La reacción se incubó una hora a 25 °C y la reacción se detuvo con la adición de 100 µL de ácido tricloroácetico (TCA) 2 mM. La reacción se enfrió en baño de hielo y se añadieron 100 µL de NaOH a 2 mM y se centrifugó a 3000 rpm por 15 minutos. La formación de p-nitrocatecol (C₆H₅NO₄) se midió a través de la absorbancia a 520 nm, comparando contra una curva de calibración de 0.5 a 5 mM de C₆H₅NO₄. Los resultados se reportaron como µmol C₆H₅NO₄/min/mg proteína/g pez.

El metabolismo de la GST isoforma tetha (GSTT) (EC 2.5.1.18) fue determinado de acuerdo con el método de Warholm et al., (1994). Se tomaron 100 µL de fracción S9, se adicionaron 150 µL de TRIS-HCl (0.5 mM pH 7.4), 20 µL de glutatión reducido (GSH) 100 mM y 5 µL de CH₂Cl₂ (grado HPLC, ≥99.8 %, Sigma-Aldrich). Se incubó a temperatura ambiente por tres horas. Se adicionaron 165 µL de TCA 2 mM, se agitó en vortex por 30 segundos y se dejó reposar por 10 min a temperatura ambiente. Se tomaron 200 µL del sobrenadante y se vertieron en otro tubo y se agregaron 600 µL de agua bidestilada y 200 µL de reactivo de Nash [3.892 M de acetato de amonio, 0.105 M de ácido acético, 0.019 M de 2,4-pentanediona (acetil-acetona)] (Kleeberg y Klinger 1982).

La mezcla se incubó a 60 °C por 30 minutos, posteriormente se enfrió en baño de hielo y se estimó la concentración de formaldehído (CH₂O) a una absorbancia de 414 nm empleando una curva estándar de 0.01 a 0.1 mM. Los resultados se expresaron como mmol CH₂O/min/mg proteína/g pez.

Activity of CYP 2E1 (EC 1.14.14.1) was evaluated according to the method of Cannady et al., (2003). An aliquot of 100 µL of fraction S9 was taken, and 400 µL of phosphates buffer (100 mM pH 6.8), µL of NADPH (50 mM) and 10 µL of p-nitrophenol at 50 mM were added. The reaction was incubated during one hour at 25 °C, and the reaction was stopped with the addition of 100 µL of trichloroacetic acid (TCA) 2 mM. The reaction was cooled in ice bath and 100 µL of NaOH at 2 mM were added, and it was centrifuged at 3,000 rpm for 15 minutes. The formation of p-nitrocatechol (C₆H₅NO₄) was measured through absorbance at 520 nm, comparing against a calibration curve of 0.5 to 5 mM of C₆H₅NO₄. Results were reported as µmol C₆H₅NO₄/min/mg protein/g fish.

The metabolism of GST tetha isoform (GSTT) (EC 2.5.1.18) was determined according to the method of Warholm et al., (1994). 100 µL of fraction S9, 150 µL of TRIS-HCI (0.5 mM pH 7.4), 20 µL of glutathione reduced (GSH) 100 mM and 5 µL of CH₂Cl₂ (grade HPLC, ≥99.8 %, Sigma-Aldrich) were added. It was incubated at room temperature for three hours. 165 µL of TCA 2 mM were added, agitated in vortex for 30 seconds and left to stand during 10 min at room temperature. 200 µL of the supernatant were taken and poured in another tube and 600 µL of bi-distilled water and 200 µL of Nash reactive [3.892 M of ammonium acetate, 0.105 M of acetic acid, 0.019 M of 2,4-pentanedione (acetyl-acetone)] were added (Kleeberg and Klinger 1982).

The mix was incubated at 60 °C for 30 minutes; after, it was cooled in ice bah and concentration of formaldehyde (CH₂O) was estimated at an absorbance of 414 nm using a standard curve of 0.01 to 0.1 mM. Results were expressed as mmol CH₂O/min/mg protein/g fish.

Especies pro-oxidantes

Pro-oxidant species

La cuantificación de ROS se realizó como en el reporte previo de Olivares-Rubio et al., (2013). Se agregaron 160 µL de solución de fluorocromos [Tomar 1 mL de solución madre de diacetato de diclorodihidrofluoresceina (DFH-DA, 625 uM) (preparar 10 mL de DFH-DA 1:10 = 62.5 uM en metanol), tomar 1 mL de dihidroetidio (DHE, 625 uM) 1:10 y disolverlos en 8 mL de solución de Hanks (120 mM de NaCl, 2.5 mM de KCl, 5.0 mM de NaHCO₃, 1.2 mM de NaH₂PO₄, 0.1 mM de MgCl₂, 6.0 mM de glucosa, 1.0 mM de CaCl₂, 10 mM de HEPES)] en placa de 96 pozos de poliestireno. Se adicionaron 20 μL de la fracción S9 y 20 μL de NADH 1.4 mM y se evaluó inmediatamente la concentración de H₂O₂ a una excitación 785 nm y a una emisión de 525 nm con el coeficiente de extinción molar de 3,800 M^-1 cm^-1 y la concentración de O₂• a una excitación de 530 nm y a una emisión de 624 nm con un coeficiente de extinción molar de 7,000 M^-1 cm^-1, los resultados se presentan como mol g^-1 pez.

El contenido de CH₂O fue medido en 200 µL de fracción S9, se añadieron 600 µL de agua y 200 µL de reactivo de Nash (Kleeberg y Klinger, 1982). La mezcla se incubó a 60 °C por 30 minutos y la absorbancia se evaluó a 414 nm para estimar el contenido de formaldehído contra una curva estándar (0.01 a 0.1 mM). Estos resultados se expresaron como mmol CH₂O/g pez.

The quantification of ROS was made as in the previous report of Olivares-Rubio et al., (2013). 160 µL of fluorochromes solution  [Take 1 mL of stock solution of diacetate of dichlorodihydrofluorescein (DFH-DA, 625 uM) (prepare 10 mL of DFH-DA 1:10 = 62.5 uM in methanol), take 1 mL of dihydroethidium (DHE, 625 uM) 1:10 and dissolve in 8 mL of Hanks solution (120 mM of NaCl, 2.5 mM of KCl, 5.0 mM of NaHCO₃, 1.2 mM of NaH₂PO₄, 0.1 mM of MgCl₂, 6.0 mM of glucose, 1.0 mM of CaCl₂, 10 mM of HEPES)] in 96-well polystyrene plate were added. 20 μL of fraction S9 and 20 μL of NADH 1.4 mM were added and the| concentration of H₂O₂ at a excitation of 785 nm was immediately evaluated, and an emission of 525 nm with the molar extinction coefficient of 3,800 M^-1 cm^-1 and the concentration of O₂• at an excitation of 530 nm and an emission of 624 nm with a molar extinction coefficient of 7,000 M^-1 cm^-1, results are presented as mol g^-1  fish.

The content of CH₂O was measured in 200 µL of fraction S9, 600 µL of water and 200 µL of Nash reactive (Kleeberg and Klinger, 1982) were added. The mix was incubated at 60 °C per 30 minutes and the absorbance was evaluated at 414 nm to estimate the content of formaldehyde using a standard curve (0.01 at 0.1 mM). These results are expressed as mmol CH₂O/g fish.

Daño oxidativo

Oxidative damage

El contenido de ROOH se evaluó en la fracción no centrifugada como una medida de daños intermedios en los ácidos grasos poliinsaturados de las membranas celulares (Hermes-Lima, 2004) siguiendo la técnica de Jiang et al., (1991). Se tomaron 200 µL del homogenado sin centrifugar y se mezclaron con 200 µL de metanol frío, agitado en vórtex (aprox. 30 seg). Se centrifugaron 5 minutos a 10,000 g, se retiró el sobrenadante y se enfrió en baño de hielo. Por otra parte, se preparó una solución como sigue: 250 µL de FeSO₄ 2.5 mM, 500 µL de H₂SO₄ 50 mM y 250 µL de naranja de xilenol 100 mM (disuelto en metanol). La mezcla se dejó incubar a 25° C durante 30 minutos, se agrega una alícuota de 60 μL del sobrenadante (homogenado y metanol) y se incubó a 25° C por 12 horas. Transcurrido ese tiempo, se adicionaron 5 μL de la solución de hidroperoxido cumeno (1 mM disuelto en metanol), se incubó a 25 °C por 30 min y se lee a 580 nm contra blanco de reactivos sin hidroperoxido cumeno, para monitorear la oxidación del hierro producida por el ROO• que genera ión férrico capaz de reaccionar con el naranja de xilenol formando un complejo colorido Fe⁺³– naranja de xilenol. La estimación de ROOH se calcula usando una curva de hidroperóxido cumeno (0 a 10 nmol).

La peroxidación lipídica evaluada como sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (SRATB) se estimó en la fracción no centrifugada con la técnica de Buege y Aust (1978). Se tomaron 200 µL de la fracción no centrifugada y se agregaron 500 µL de solución reguladora de TRIS-HCl 150 mM (pH 7.4) y se incubó a 37 °C por 30 minutos. Se añadió 1 mL de ácido tiobarbitúrico (0.375 % p/v en TCA al 15 % v/v) y la reacción se llevó a ebullición por 45 minutos. Se enfrió en baño de hielo y se centrifugó a 2,500 rpm por 5 minutos y la absorbancia se leyó a 535 nm para cuantificar el malondialdehído mediante su coeficiente de extinción molar de (156,000 M^-1 cm^-1). Los resultados se expresaron como mmol ROOH/g pez y µmol SRATB/g pez para hidroperóxidos lipídicos y peroxidación lipídica, respectivamente.

La oxidación de proteínas se determinó mediante el protocolo de Levine et al., (1994), basado en la reacción de carbonilos en proteínas (RC=O) con la 2,4-dinitrophenil hidrazina (DNPH) en medio ácido para generar dinitrofenilhidrazonas con absorbancia máxima a 366 nm. Se tomaron 500 µL de la fracción no centrifugada y se precipitaron con 100 µL de TCA al 30 % v/v en agitación lenta, se centrifugó a 3,000 rpm/ 5 minutos y se desechó el sobrenadante. Se agregó al precipitado 500 µL de 2,4-dinitrofenil hidrazina (DNPH 20 mM en HCl 2N), se agitó y se guardó a la oscuridad por 1 hora, agitando cada 10 min. Se preparó un blanco de reactivos solo con PBS y 500 µL de HCl 2N. Transcurrido el tiempo de reposo, se volvió a precipitar con 500 µL de TCA al 30 %, se centrifugó a 3,000 rpm/5 min y se desechó el sobrenadante. El precipitado se lavó tres veces con 1 mL de etanol-etil acetato (1:1 v/v) para eliminar el exceso de DNPH y se centrifugó cada lavado a 3,000 rpm cada 5 minutos. El sobrenadante se desechó y el precipitado se disolvió con 1.0 mL de urea (6 M en fosfato de potasio 20 mM pH 2.5). Se incubó 1 hora a 37° C previa agitación en vortex. La absorbancia se evaluó a 366 nm y se calculó la oxidación de proteínas por el CEM por medio de la formación de dinitrofenilhidrazonas (22 mM^-1cm^-1). Los resultados se presentan como mmol RC=O/mg proteína/g pez.

The content of ROOH was evaluated in the non-centrifuged fraction as a measurement for intermediate damages in the polyunsaturated fatty acids of the cell membranes (Hermes-Lima, 2004) following the technique of Jiang et al., (1991). 200 µL of the non-centrifuged homogenized were taken and added with 200 µL of cold methanol, agitated in vortex (approximately 30 seconds). They were centrifuged during 5 minutes at 10,000 g, the supernatant was withdrawn and cooled in ice bath. On the other hand, a solution was prepared as follows: 250 µL of FeSO₄ 2.5 mM, 500 µL of H₂SO₄ 50 mM and 250 µL of orange of xylene 100 mM (dissolved in methanol). The mix was incubated at 25 °C during 30 minutes, an aliquot of 60 μL of the supernatant (homogenized and methanol) was added and incubated at 25 °C for 12 hours. After that time, 5 μL of the solution of cumene hydroperoxide (1 mM dissolved in methanol) were added, incubated at 25 °C for 30 minutes and it was read at 580 against reagent blank without cumene hydroperoxide, to monitor oxidation of iron produced by the ROO• that generated ferric ion capable of reacting with the orange of xylene forming a colorful complex Fe⁺³– orange of xylene. The estimation of ROOH is calculated using a cumene hydroperoxide curve (0 to 10 nmol).

Evaluated lipid peroxidation as reactive substances to thiobarbituric acid (SRATB) was estimated in the non-centrifuged fraction with the technique of Buege and Aust (1978). 200 µL of the non-centrifuged fraction were taken and added with 500 µL of buffer solution TRIS-HCl 150 mM (pH 7.4) and incubated at 37 °C for 30 minutes. 1 mL of thiobarbituric acid (0.375 % p/v in TCA at 15 % v/v) was added and the reaction was boiled for 45 minutes. It was cooled in ice bath and centrifuged at 2,500 rpm for 5 minutes; absorbance was read at 535 nm to quantify the malondialdehyde by its molar extinction coefficient of (156,000 M^-1 cm^-1). Results were expressed as mmol ROOH/g fish and µmol SRATB/g fish for lipid hydro-peroxide and lipid peroxidation, respectively.

Protein oxidation was determined by protocol of Levine et al., (1994), based in the reaction of protein carbonyls (RC=O) with 2,4-dinitrophenil hydrazine (DNPH) in acid mean to generate dinitrophenylhydrazines with maximum absorbance at 366 nm. 500 µL of the non-centrifuged fraction were taken and precipitated with 100 µL of TCA at 30 % v/v in slow agitation, centrifuged at 3,000 rpm/5 minutes and the supernatant was discharged. 500 µL of 2,4 -dinitrophenyl hydrazine (DNPH 20 mM in HCI 2N) were added to the precipitated, and was agitated and kept in the dark for 1 hour, agitating every 10 min. A reagent blank was prepared only with PBS and 500 µL of HCI 2N. After standing time, it was precipitated again with 500 µL of TCA at 30 %, centrifuged at 3,000 rpm/5 min and the supernatant was disregarded. The precipitated was washed three times with 1 mL of ethanol-ethyl acetate (1:1 v/v) to eliminate the excess of DNPH and every wash was centrifuged at 3,000 rpm every 5 minutes. The supernatant was dischargedand the precipitated was dissolved with 1.0 mL of urea (6 M in potassium phosphate 20 mM pH 2.5). It was incubated 1 hour at 37 °C previous agitation in vortex. The absorbance was evaluated at 366 nm and oxidation of proteins was calculated by CEM through the formation of dinitrophenylhidrazones (22 mM^-1 cm^-1). Results are presented as mmol RC=O/mg protein/g fish.

Enzymes involved in the antioxidant defense

La actividad de la superóxido dismutasa (SOD; EC 1.15.1.1) se evaluó de acuerdo al método de Misra y Fridovich (1972) con modificaciones: se adicionaron 20 µL de fracción S9 a la celda de cuarzo de 1 cm³  y se agregaron 800 μL de buffer de prueba (50 mM de NaCO₃ y 0.1 mM de EDTA); posteriormente, se añadieron 10 µL de NADH 0.03 mM y la absorbancia se determinó a 340 nm cada 30 seg durante 5 min contra un blanco de reactivos. La actividad de la enzima se calculó mediante el consumo del NADH a través de su coeficiente de extinción molar (6.22 mM^-1 cm^-1). La actividad de la catalasa (CAT; EC 1.11.1.6) se evaluó por el método de Radi et al., (1991): se tomaron 20 µL de fracción S9 y se añadieron 800 µL de la solución amortiguadora de aislamiento (0.3 M sucrosa, 1 mM EDTA, 5 mM HEPES y 5 mM KH₂PO₄) en celda de cuarzo y 200 µL de H₂O₂ 20 mM y se registró la absorbancia a 240 nm a los 0, 30 y 60 segundos para evaluar el consumo de H₂O₂ empleando su coeficiente de extinción molar de 0.043 mM^-1 cm^-1. El metabolismo de la glutatión peroxidasa dependiente de selenio (GPx; EC 1.11.1.9) se cuantificó de acuerdo a Lei et al., (1995) con modificaciones: se tomaron 20 µL de fracción S9, se añadieron 800 µL de buffer de reacción (0.5 M de TRIS-HCl, 25 mM de EDTA, 5 mM NaN₃, pH 7.4), 10 µL de glutatión reductasa a 1.2x10^-5 U/L, 20 µL de H₂O₂ y 10 µL de NADH a 0.03 mM y la absorbancia se monitoreo a 340 nm cada 30 segundos por 5 minutos para evaluar el consumo de NADH.

La actividad total de la glutation S-transferasa (GST) se evaluó por el método espectrofotométrico de Boryslawskyj et al., (1988) con modificaciones: se tomaron 20 µL de fracción S9, se añadieron a la celda 800 µL de buffer de reacción (100 mM de fosfato de potasio, pH 6.5), 5 µL de glutatión reducido a 1 mM.; posteriormente, se midió la absorbancia a 430 nm cada 30 segundos por 5 minutos para evaluar la formación del complejo 2,4-dicloronitrobenceno-glutatión empleando un coeficiente de extinción molar de 8.5 mM^-1 cm^-1 (Habig et al., 1974). El contenido de proteínas totales se determinó utilizando el kit Thermo Scientific Pierce® 660nm protein assay. Las actividades de SOD, CAT, GPx y GST se expresaron en mmol/min/mg de proteína/g de pez.

The activity of the superoxide dismutase (SOD; EC 1.15.1.1) was evaluated according to the method of Misra and Fridovich (1972) with modifications: 20 µL of fraction S9 were added to the quartz cell of 1 cm³ and 800 µL of test buffer (50 mM de NaCO₃ and 0.1 mM of EDTA) were added; after, 10 µL of NADH 0.03 mM were added and the absorbance was determined at 340 nm every 30 sec during 5 min against a reagent blank. The activity of the enzyme was calculated by consumption of NADH through its molar extinction coefficient (6.22 mM^-1 cm^-1). The catalase activity (CAT; EC 1.11.1.6) was evaluated using the method by Radi et al., (1991): 20 µL of the fraction S9 were taken and 800 µL of the padding buffer solution (0.3 M sucrose, 1 mM EDTA, 5 mM HEPES and 5 mM KH₂PO₄) were added in quartz cell and 200 µL of H₂O₂ 20 mM and the absorbance was recorded at 240 nm at 0, 30 and 60 seconds to evaluate the consumption of H₂O₂ using its molar extinction coefficient of 0.043 mM^-1 cm^-1. The metabolism of the glutathione peroxidase dependent on selenium (GPx; EC 1.11.1.9) was quantified according to Lei et al., (1995) with modifications: 20 µL of fraction S9 were taken, 800 µL of reaction buffer (0.5 M of TRIS-HCl, 25 mM of EDTA, 5 mM NaN₃, pH 7.4) were added, 10 µL of glutathione reductase at 1.2x10^-5 U/L, 20 µL of H₂O₂ and 10 µL of NADH at 0.03 mM were added, and the absorbance was monitored at 340 nm every 30 seconds per 5 minutes to evaluate the consumption of NADH.

The total activity of the glutathione S-transferase (GST) was evaluated using the spectrophotometric method of Boryslawskyj et al., (1988) with modifications: 20 µL of fraction S9 were taken, 800 µL of reaction buffer (100 mM of potassium phosphate, pH 6.5) were added, 5 µL of glutathione reduced at 1 mM; after, absorbance was measured at 430 nm every 30 seconds for 5 minutes to evaluate the formation of the complex 2,4- dichloronitrobenzene-glutathione using a molar extinction coefficient of 8.5 mM^-1 cm^-1 (Habig et al., 1974). The content of total proteins was determined using the kit Thermo Scientific Pierce® 660nm protein assay. The activities of SOD, CAT, GPx and GST are expressed in mmol/min/mg of protein/g of fish.

Análisis estadísticos

Statistical analysis

La respuesta de los biomarcadores de los especímenes de prueba con respecto al control se comparó con un ANOVA de una vía con prueba posterior de Dunnett utilizando GraphPad Prism versión 5.00 para Windows, GraphPad Software, San Diego California. Los resultados se consideraron significativos a valores de p≤0.05.

The response of the biomarkers of the test specimens regarding control was compared with one way posterior test ANOVA of Dunnett using GraphPad Prism version 5.00 for Windows, GraphPad Software, San Diego California. Results are considered significant to values of p≤0.05.

Resultados y Discusión

Results and Discussion

La actividad renal de CYP 2E1 presentó un patrón de respuesta similar entre los peces expuestos a CH₂Cl₂ y BrCHCl₂. La actividad máxima se detectó en los tratamientos de 0.03 mg CH₂Cl₂/L y de 0.01 mg BrCHCl₂/L, la cual fue significativa (p<0.01). Sin embargo, esta enzima se abatió a la mayor concentración de manera no significativa (Figuras 1A y 1C). En los peces expuestos a CHCl₃ en todos los tratamientos el metabolismo de CYP 2E1 fue menor que el control sin ser un hallazgo significativo (Figura 1B). Por otro lado, la actividad renal de GSTT resultó ser similar entre los HM bajo estudio con un pico de actividad a bajas concentraciones y, a mayores concentraciones hubo reducciones sin diferencias significativas (Figuras 1D, 1E y 1F). Al respecto, se han reportado abatimientos en la actividad hepática del CYP 2E1 en la carpa común expuesta al agua tratada con precursores de HM en condiciones controladas (Sapone et al., 2007). En estudios previos de Olivares-Rubio et al., (2013) se reportaron abatimientos en la actividad de estas enzimas (CYP 2E1 y GSTT) responsables de la biotransformación de HM en el hígado y en el riñón del tiro oscuro habitante de tres lagos del centro de México donde se estimaron contenidos de HM en el orden de µg L^-1. En el hígado y en las vísceras de charal (Chirostoma riojai) de la Laguna de Zumpango, Estado de México, México, se encontraron incrementos únicamente en la actividad de CYP 2E1, mientras que la GSTT presentó abatimientos (Vega-López et al., 2012). Las diferencias registradas en los metabolismos de estas enzimas pueden deberse a la fisiología de estas especies de peces, así como del estado de contaminación de los ambientes que habitan, pero sobre todo indican desregulaciones en los procesos de bioactivación (Parkinson y Ogilvie, 2008). Además, en condiciones naturales existe una gran variedad de inductores y supresores de estas enzimas, donde la respuesta de los biomarcadores es compleja y multifactorial. Este conjunto de hallazgos sugiere que los HM son capaces de inducir daño oxidativo inclusive en las enzimas que los biotransforman (CYP 2E1 y GSTT) mediante la producción de especies extremadamente reactivas como el fosgeno, N-(2-oxotiazolodina-4-carbonil)-glicina y HCl (Uraga-Tovar et al., 2014). Un detallado esquema sobre la formación de especies reactivas y oxidantes, así como de la producción de ROS producto de la biotransformación de los HM bajo estudio, puede ser consultado en Uraga-Tovar et al., (2014). Por otro lado, Dzul Caamal et al., (2013) reportaron incrementos en la actividad hepática de estas enzimas en G. gracilis expuesto a estos tóxicos; mientras que en el presente trabajo la respuesta renal tuvo relación con el tipo de HM. Estas diferencias pueden deberse a la funcionalidad de ambos órganos, el hígado por su volumen corporal es el sitio principal de biotransformación (Kleinow et al., 1987) y el riñón es el principal órgano hematopoyético de los peces (Davidson y Zon, 2004), pero en éste también ocurre la biotransformación (Schnellmann, 2008).

Renal activity of CYP 2E1 presented a pattern of similar response amongst the fishes exposed to CH₂Cl₂ and BrCHCl₂. The maximum activity was detected in treatments of 0.03 mg CH₂Cl₂/L and 0.01 mg BrCHCl₂/L, which was significant (p<0.01). Nevertheless, this enzyme was tumbled at the higher concentration in a non-significant form (Figures 1A and 1C). In fishes exposed to CHCl₃ in all treatments, the metabolism of CYP 2E1 was lower than control, not representing a significant finding (Figure 1B). On the other hand, renal activity of GSTT resulted similar between the HM under study, with a peak of activity at low concentrations, and at higher concentrations, there were reductions with no significant differences (Figures 1D, 1E and 1F). In this regard, there have been despondencies in the hepatic activity of CYP 2E1 in the common carp exposed to water treated with precursors of HM in controlled conditions (Sapone et al., 2007). In previous studies from Olivares-Rubio et al., (2013), despondencies in in the activity of these enzymes (CYP 2E1 and GSTT) responsible for the biotransformation of HM in liver and kidney of dusky splitfin, inhabitant of three lakes in central Mexico, were content of HM were estimated in the order of µg L^-1. In liver and guts of charal fish (Chirostoma riojai) from the Laguna of Zumpango, Estado de Mexico, Mexico, increase only in the activity of CYP 2E1 were found, while GSST presented despondencies (Vega-López et al., 2012). The recorded differences in the metabolisms of these enzymes can be due to the physiology of these species, and the state of pollution in the environments they inhabit, but mostly, they indicate dysregulations in the bioactivation processes (Parkinson and Ogilvie, 2008). Besides, in natural conditions there is a great variety of inductors and suppressors of these enzymes, where the response of the biomarkers is complex and multifactorial. These gathering of findings suggests that HM are able to induce oxidative damage even in the enzymes that biotransform them (CYP 2E1 and GSTT) by production of species extremely reactive to phosgene, N-(2-oxothiazolidine-4-carbonyl)-glycine and HCl (Uraga-Tovar et al., 2014). A detailed scheme on the formation of reactive and oxidative species, as the production of ROS, product of the biotransformation of HMs under study, can be consulted in Uraga-Tovar et al., (2014). On the other hand, Dzul Caamal et al., (2013) reported increases in the hepatic activity of these enzymes in G. gracillis exposed to these toxics; while in this work, the renal response was related with the type of HM. These differences can be due to the functionality of both organs; for its corporal volume, liver is the main site of biotransformation (Kleinow et al., 1987) and kidney is the main hematopoietic organ of fishes (Davidson and Zon, 2004), but in the latter, biotransformation also occurs (Schnellmann, 2008).

Fuerzas pro-oxidantes (O₂•, H₂O₂ y CH₂O)

Pro-oxidant forces (O₂•, H₂O₂ and CH₂O)

En el riñón de los ejemplares control, la concentración de H2O2 fue mayor que el O₂•. En los peces tratados con CH₂Cl₂, en todos los tratamientos el contenido de O₂• estuvo mas elevado que en controles y también comparativamente con el H₂O₂ (Figura 2A). Sin embargo, y de manera general, en el riñón del tiro oscuro expuesto a CHCl3, la concentración de O₂• y H₂O₂ tuvo una respuesta inversa con la concentración (Figura 2B). Por efecto del BrCHCl₂, el H₂O₂ se incrementó y el O₂• se abatió respecto al control, casi de manera proporcional (Figura 2C).

El O₂ participa en la selección negativa y positiva de las células progenitoras hematopoyéticas que ocurre en la cabeza del riñón; en adición, las células inmunocompetentes producen ROS como mecanismo de defensa (Janeway y Medzhitov 2002; Davidson y Zon, 2004). Además, la generación de estas especies químicas son producto de un conjunto de enzimas con actividad oxido-reductasa (Lushchak, 2011). El contenido renal de H₂O₂ fue más elevado que el de O2• en los peces control, el cual puede explicarse por la autodismutación del anión superóxido a H₂O₂ (Hermes-Lima, 2004), además del HO• y peroxidasas de H₂O₂ que pueden también oxidar al diacetato de dihidrofluoresceina (Gutteridge y Halliwell, 2010). Vega-López et al., (2009a) sugieren que a través de la actividad del CYP 450 se pueden generar ROS, mediante el desacoplamiento en el flujo de electrones durante su catálisis. De manera contundente se ha demostrado que la actividad de la isoforma 2E1 del CYP 450 está involucrado en la generación de ROS, particularmente del O₂•, H₂O₂ y de radicales hidroxietilados (Linhart et al., 2014). Esto indica que a mayor actividad renal del CYP 2E1 en G. gracilis expuesta a CH₂Cl₂ y BrCHCl₂ se generan ROS. En los cuerpos de agua donde habita el tiro oscuro se detectaron HM y en estos ejemplares se presentó un abatimiento en el contenido de H₂O₂ en el hígado y en el riñón, mientras que el O₂• fue mayor en los peces no expuestos (Olivares-Rubio et al., 2013). A pesar de los efectos tóxicos de los HM, no se descarta que la selección de células inmunocompetentes en el pronefros contribuyera también con las variaciones detectadas de ROS en el estudio actual. En adición, las células activadas por respuesta inmune de la cabeza del riñón de los peces inducen a estas especies químicas, contribuyendo a su alto dinamismo en el ambiente celular.

Los niveles de formaldehído inducidos por CH₂Cl₂ y CHCl₃ estuvieron por debajo del basal; no obstante, el CHCl₃ a 1, 10 y 100 mg L^-1 causó un incremento en la concentración de CH₂O dependiente del tratamiento pero sin alcanzar los niveles de los controles (Figuras 2D y 2E). Esta respuesta puede deberse a la autorregulación del CYP 2E1, principalmente en los especímenes expuestos a HM clorados. En el mismo sentido es pausible que el metabolismo de la GSTT aportara también CH₂O como uno de sus metabolitos; sin embargo, no hubo relación evidente como se observó con el CYP 2E1. Dzul-Caamal et al., (2013) registraron incrementos significativos de formaldehído en el hígado del tiro oscuro tratado en las mismas condiciones del presente estudio; además en este órgano se estimó una mayor catálisis del CYP 2E1 y de la GSTT respecto al control. En contraste, el BrCHCl₂ indujo un notable incremento en la concentración renal de CH₂O (p<0.01 y p<0.001; Figuras 2F) que coincide con incrementos en la actividad CYP 2E1. Este hallazgo está en concordancia con reportes previos donde se ha demostrado que este citocromo puede producir compuestos como el CH₂O (Dekant y Vamvakas, 1993). Sin embargo, en peces estos mecanismos de toxicidad han sido poco estudiados (Teuschler et al., 2000; Sapone et al., 2007; Dzul-Caamal et al., 2013; Uraga-Tovar et al., 2014). El conjunto de eventos observados en el presente estudio y hallazgos previos sugieren que la actividad de las enzimas involucradas en la biotransformación de HM es una fuente importante de CH₂O, en particular la isoforma 2E1 del CYP 450.

Concentration of H₂O₂ was higher than O₂• in the kidney of control specimens. In fishes treated with CH₂Cl₂, in all treatments, the content of O₂• was higher than in control, and also comparatively with H₂O₂ (Figure 2A). However, in the kidney of dusky splitfin exposed to CHCl3, concentration of O₂• and H₂O₂ had an inverse response with the concentration (Figure 2B) overall. By effect of BrCHCl₂, H₂O₂ increased and O₂• was deflated regarding control, almost proportionally (Figure 2C).

O₂ participates in the negative and positive selection of hematopoietic progenitor cells that occurs in the head of the kidney; in addition, immunocompetent cells produce ROS as defense mechanism (Janeway and Medzhitov 2002; Davidson and Zon, 2004). Besides, the generation of these chemical species are product of a group of enzymes with oxide-reductase activity (Lushchak, 2011). The renal content of H2O2 was more elevated than O₂• in control, which can be explained by the autodismutation of the superoxide anion to H₂O₂ (Hermes-Lima, 2004), besides HO• and peroxidases of H₂O₂ that can also oxide diacetate of dihydrofluorescein (Gutteridge and Halliwell, 2010). Vega-López et al., (2009a) suggest that through the activity of CYP 450 ROS can be generated, by the decoupling in the flux of electrons during its catalysis. It has been shown that the activity of the isoform 2E1 of CYP 450 is involving the generation of ROS, particularly O₂•, H₂O₂ and hydroxyethyl radicals (Linhart et al., 2014). This indicates that at a higher renal activity of CYP 2E1 in G. gracilis exposed to CH₂Cl₂ and BrCHCl₂, ROS are generated. In the water bodies where dusky splitfin inhabits, HMs were detected, and in these specimens a dejection in the content of H2O2 in liver and kidney was presented, whilst O₂• was higher in non-exposed fishes (Olivares-Rubio et al., 2013). Despite the toxic effects of the HM, the contribution of selection of immunocompetent cells in the pronephros with the variations detected in ROS in this study is not disregarded. In addition, activated cells by immune response of the kidney’s head of fishes induce these chemical species, contributing to its high dynamism in the cellular environment.

The levels of formaldehyde induced by CH₂Cl₂ and CHCl₃ were under basal; nevertheless, CHCl₃ to 1, 10 y 100 mg L^-1 caused an increase in the concentration of CH₂O depending on the treatment but without reaching the levels of controls (Figures 2D and 2E). This response can be due to the autoregulation of CYP 2E1, mainly in the specimens exposed to chlorinated HM. In this sense, is plausible that the metabolism of the GSTT, CH₂O also contributed as one of its metabolites; however, there was no evident relationship as observed with the CYP 2E1. Dzul-Caamal et al., (2013) recorded significant increases of formaldehyde in the liver of dusky splitfin treated in the same conditions as this study; besides, a higher catalysis of CYP 2E1 and GSTT regarding control was estimated. In contrast, the BrCHCl₂ induced a noticeable increase in the renal concentration of CH₂O (p<0.01 and p<0.001; Figures 2F) which coincides with the increases in the activity CYP 2E1. This finding is in accordance to previous reports where it has been shown that this cytochrome can produce compounds as CH₂O (Dekant and Vamvakas, 1993). However, these mechanisms of toxicity have been poorly studied in studied fishes (Teuschler et al., 2000; Sapone et al., 2007; Dzul-Caamal et al., 2013; Uraga-Tovar et al., 2014). The group of events observed in this study and previous findings suggest that the activity of the enzymes involved in the biotransformation of HM is an important source of CH₂O, in particular, the isoform 2E1 del CYP 450.

Daño oxidativo (ROOH, SRATB and RC=O)

Oxidative damage (ROOH, SRATB and RC=O)

Solo el CH₂Cl₂ fue capaz de incrementar daños en las membranas celulares (ROOH y SRATB) de manera dependiente de la concentración (Figura 3A). Lo anterior indica que la oxidación de fosfolípidos de membrana ocurrió tanto en estadios intermedios (ROOH) como terminales (SRATB). Por otra parte, el CHCl₃ provocó un daño máximo a concentraciones bajas (0.01 mg L^-1 para ROOH y 0.1 mg L^-1 para SRATB) y posteriormente hubo abatimientos con respecto a los peces no expuestos (Figura 3B). Los niveles renales de ROOH del tiro oscuro tratado con BrCHCl₂ fueron ligeramente mayores que en el control. En contraste, las SRATB tuvieron un decremento inversamente proporcional con las concentraciones de prueba (Figura 3C) fenómeno que se puede vincular con los bajos contenidos de O₂•. Reportes previos de Dzul-Caamal et al., (2013) indican que la peroxidación lipídica en el hígado de G. gracilis fue mayor que en los controles. Probablemente la inducción de compuestos reactivos y oxidantes generados por CYP 2E1 y GSTT participan en el proceso oxidativo. Además la GPx puede neutralizar al ROO• para formar alcoholes (Thomas et al., 1990) o por reacciones radicalarias es factible la formación de polímeros con baja actividad biológica (Gregus, 2008).

El contenido de RC=O fue menor en los riñones de los peces tratados con CH₂Cl₂ respecto al control (Figura 3D). Solamente a concentraciones bajas de BrCHCl₂ (0.002 y 0.01 mg L^-1) la oxidación de proteínas estuvo por arriba de los controles, mientras que en el resto de los tratamientos los niveles de RC=O fueron menores (Figura 3F). En contraste, en los ejemplares de tiro oscuro expuestos a CHCl3 los niveles de RC=O estuvieron por arriba de los controles (p<0.05 y p<0.01; Figura 3E). En algunos cuerpos de agua el contenido renal de RC=O en G. gracilis estuvo por debajo de los controles (Olivares-Rubio et al., 2013) como fue observado también en los peces expuestos a CH₂Cl₂ y BrCHCl₂. Es probable que tanto en el ambiente acuático como en condiciones controladas, la oxidación de proteínas halla disminuido debido a los procesos de ubiquitinación dependiente de ATP por la vía de proteasas endógenas como la catepsina c, calpaina y tripsina así como por acción del proteasoma como una medida de autorregulación (Hermes-Lima, 2004).

Only CH₂Cl₂ was capable of increasing damages in the cellular membranes (ROOH and SRATB) dependently from the concentration (Figure 3A). The latter indicates that the oxidation in phospholipids of the membrane occurred in both intermediate (ROOH) and terminal (SRATB) stages. On the other hand, CHCl₃ provoked maximum damage at low concentrations (0.01 mg L^-1 for ROOH and 0.1 mg L^-1 for SRATB) and after, there were dejections regarding non-exposed fish (Figure 3B). Renal levels of ROOH of dusky splitfin treated with BrCHCl₂ were slightly higher than control. In contrast, SRATB had an inversely proportional decrease with the test concentrations (Figure 3C), phenomena that can be linked to the low contents of O₂•. Previous reports from Dzul-Caamal et al., (2013) indicate that lipid peroxidation in liver of G. gracilis was higher than in controls. Probably, the induction of reactive and oxidant compounds generated by CYP 2E1 and GSTT participate in the oxidative process. In addition, the GPx can neutralize ROO• to form alcohols (Thomas et al., 1990), or by radical reactions, the formation of polymers with low biological activity is feasible (Gregus, 2008).

The content of RC=O was minor in the kidneys of fishes treated with CH₂Cl₂ respect to control (Figure 3D). Only at low concentrations of BrCHCl2 (0.002 and 0.01 mg L^-1) oxidation of proteins was above controls, while in the rest of treatments, levels of RC=O were lower (Figure 3F). In contrast, in specimens of dusky splitfin exposed to CHCl3 levels of RC=O were above controls (p<0.05 and p<0.01; Figure 3E). In some water bodies, the renal content of RC=O in G. gracilis was below controls (Olivares-Rubio et al., 2013), as it was also observed in fishes exposed to CH₂Cl₂ and BrCHCl₂. It is probable that in both the aquatic environment and controlled conditions, oxidation of proteins has decreased due to processes of ubiquitination depending of ATP through endogenous proteases, as the cathepsin c, calpain and trypsin, and by action of the proteasome as a mechanism of autoregulation (Hermes-Lima, 2004).

Enzimas involucradas en la defensa antioxidante (SOD, CAT y GPx) y GST

Enzymes involved in the antioxidant defense (SOD, CAT and GPx) and GST

De manera general, la actividad renal SOD de los peces tratados con HM clorados (CH₂Cl₂ y CHCl₂) fue mayor respecto a la respuesta de los controles (p<0.05; CHCl₃ a 0.1 mg L^-1); mientras que en los expuestos a BrCHCl₂ el metabolismo de esta enzima fue menor con relación al grupo control (Figuras 4A, 4B y 4C). No se descarta que la catálisis de SOD halla participado en mantenimiento homeostático de O₂• en el riñón del tiro oscuro. Posiblemente porque este tejido es el principal órgano hematopoyético y la producción de O₂• es un mecanismo de defensa de la inmunidad innata. Resultados similares fueron encontrados en el hígado de G. gracilis expuesto en las mismas condiciones del presente estudio (Dzul-Caamal et al., 2013). No obstante, el BrCHCl₂ redujo la actividad de SOD en el riñón de G. gracilis probablemente por daños en el sitio activo de esta enzima o por un desequilibrio en la oxidación de NADP+ (Olivares-Rubio et al., 2013).

En G. gracilis tratada con CH₂Cl₂ la actividad renal de CAT fue mayor que en los controles (p<0.01 y p<0.001) en contraste con los peces expuestos a CHCl₃. Pero con BrCHCl₂ la catálisis de esta enzima estuvo irregular (Figuras 4A, 4B y 4C). De manera general, la actividad renal de GPx en G. gracilis expuesto a CH₂Cl₂ y BrCHCl₂ fue mayor que los controles, caso contrario con el CHCl₃ donde se detectó una relación inversa con la concentración de los tratamientos (Figuras 4A, 4B y 4C). La CAT y GPx participan en la reducción del H₂O₂ a H₂O (Hermes-Lima, 2004). En el caso de incrementos de ambas enzimas es probable que el H₂O₂ producido por la catálisis de SOD o por la autodismutación de O₂• contribuyeran con la inducción de CAT y GPx mediante incrementos en la concentración de su sustrato. Sin embargo, en el caso de abatimientos es factible que otras fuerzas oxidantes y reactivas derivadas de la biotransformación de HM provocaron daños al sitio activo de estas enzimas alterando su catálisis como se ha sugerido para la CAT de Ameca splendens expuesta a bifenilos policlorados (Vega-Lopéz et al., 2009b). No fue posible observar de manera clara relaciones entre la actividad de estas defensas antioxidantes (SOD, CAT y GPx) y el contenido de ROS (O₂• y H₂O₂). Los fenómenos anteriores sugieren que la actividad de la defensa antioxidante en el riñón de G. gracilis es compleja y puede alterarse por varios factores intrínsecos y medioambientales.
En los ejemplares de tiro oscuro tratados con CHCl₃ la actividad de GST fue menor respecto al grupo control, con excepción de 0.01 y 0.1 mg CHCl₃/L (Figura 4E). Por otra parte, la actividad de esta enzima fue similar e irregular respecto al control y entre tratamientos en los peces expuestos a BrCHCl₂ (Figura 4F). Estos hallazgos son similares a los encontrados en el riñón de esta especie habitante de tres lagos en el Centro de México, donde el metabolismo de GST fue menor a los controles. Un fenómeno que puede explicarse a través de la disrupción de las rutas de conjugación con glutatión (Olivares-Rubio et al., 2013). En contraste, la actividad renal de GST presentó una respuesta concentración-dependiente de 0.006 a 0.6 mg CH₂Cl₂/L (Figura 4D). La respuesta observada concuerda con la catálisis hepática de GST de la carpa común expuesta por 10 y 20 días al ClO₂, NaClO y al ácido paracético (Elia et al., 2006) probablemente por la alta estereoselectividad de la GST para varios sustratos electrofílicos (Mannervik et al., 1988).

Debido a sus funciones en la respuesta inmune y en la filtración, el riñón parece ser un tejido poco sensible a los efectos de los HM en condiciones controladas. Más estudios son requeridos para determinar si la presencia de los HM en los cuerpos de agua representa un riesgo significativo para la ictiofauna y otros organismos acuáticos.

Overall, renal activity SOD of fishes treated with chlorinated HM (CH₂Cl₂ and CHCl₃) was higher with respect to the response of controls (p<0.05; CHCl₃ to 0.1 mg L^-1); while in those exposed to BrCHCl₂, the metabolism of this enzyme was lower in relation to control group (Figures 4A, 4B and 4C). The participation of SOD catalysis in homeostatic maintenance of O₂• in the kidney of dusky splitfin is not disregarded. Probably, because this tissue is the main hematopoietic organ and production of O₂• is a defense mechanism in the innate immunity. Similar results were found in the liver of G. gracilis exposed in the same conditions in this study (Dzul-Caamal et al., 2013). Nevertheless, the BrCHCl₂ reduced the SOD activity in the kidney of G. gracilis, probably by damages in the active site of this enzyme or by an unbalance in the oxidation of NADP+ (Olivares-Rubio et al., 2013).

In G. gracilis treated with CH₂Cl₂ renal activity of CAT was higher than in controls (p<0.01 and p<0.001) in contrast to fishes exposed to CHCl₃. But with BrCHCl₂, catalysis of this enzyme was irregular (Figures 4A, 4B and 4C). Generally, renal activity of GPx in G. gracilis exposed to CH₂Cl₂ and BrCHCl₂ was higher with controls, contrary to CHCl₃, where an inverse relation with the concentration of treatments was detected (Figures 4A, 4B and 4C). CAT and GPx participate in the reduction of H₂O₂ to H₂O (Hermes-Lima, 2004). In the case of increases in both enzymes, it is likely that H₂O₂ produced by the catalysis of SOD or by auto-dismutation of O₂• contributed to the induction of CAT and GPx by increases in the concentration of their substrate. Nevertheless, in the case of dejections, it is feasible that other oxidative and reactive forces derived from biotransformation of HM provoked damages to the active site of these enzymes, altering their catalysis, as it has been suggested for CAT of Ameca splendens exposed to polychlorinated biphenyls (Vega-Lopéz et al., 2009b). It was not possible to clearly observe relations between the activity of these antioxidant defenses (SOD, CAT and GPx) and the content of ROS (O₂• and H₂O₂). The previous phenomena suggest that the activity of the antioxidant defense in the kidney of G. gracilis is complex, and can be altered by several intrinsic and environmental factors.

In specimens of dusky splitfin treated with CHCl₃ the activity of GST was lower respect to control, with exception of 0.01 and 0.1 mg CHCl₃/L (Figure 4E). On the other hand, the activity of this enzyme was similar and irregular with respect to control, and between treatments in fishes exposed to BrCHCl2 (Figure 4F). These findings are similar to those found in the kidney of this species inhabiting in three lakes in Central Mexico, where the metabolism of GST was lower than controls. A phenomena that can be explained through the disruption of the conjugation routes with glutathione (Olivares-Rubio et al., 2013). In contrast, the renal activity of GST presented a concentration-dependent response of 0.006 to 0.6 mg CH₂Cl₂/L (Figure 4D). The observed response agrees with the hepatic catalysis of GST of common carp exposed for 10 and 20 days to ClO₂, NaClO and paracetic acid (Elia et al., 2006), probably by the high stereo-selectivity of GST for several electrophilic substrates (Mannervik et al., 1988).

Due to its functions in the immune response and the filtration, the kidney seems to be a low sensible tissue to the effects of HM in controlled conditions. Further studies are required to determine if the presence of HM in the bodies of water represents a significant risk for the icthyofauna and other aquatic organisms.